SMYD3基因在急性髓系白血病中的表达及其临床意义

张怡 王娟娟 马超 徐凯红 欧阳桂芳 牧启田

【摘要】 目的：研究SMYD3基因在急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）中的表达情况，探讨其临床意义。方法：收集2012年9月-2015年7月在本院就诊的初发AML骨髓样本87例，非肿瘤患者骨髓20例为对照样本，实时荧光定量PCR检测SMYD3基因表达水平，统计分析其与临床特征的关系。结果：初发AML的SMYD3基因表达水平明显高于对照组（P<0.001）;将AML分为M3组与非M3组，M3组与非M3组的SMYD3基因表达水平均明显高于对照组（P<0.001）;非M3组的SMYD3基因表达水平高于M3组（P<0.05），年龄大于M3组和对照组（P<0.05）。结论：SMYD3在初发AML中呈现高表达，是一种AML相关基因，非M3比M3有更高的SMYD3表达水平。

【关键词】 SMYD3 急性髓系白血病 基因表达

Expression Level of SMYD3 Gene in Acute Myeloid Leukemia and Its Clinical Significance/ZHANG Yi， WANG Juanjuan， MA Chao， XU Kaihong， OUYANG Guifang， MU Qitian. //Medical Innovation of China， 2021， 18（29）： 0-026

[Abstract] Objective： To investigate the expression level of SMYD3 gene in patients with acute myeloid leukemia （AML） and to evaluate its clinical significance. Method： A total of 87 bone marrow samples of AML patients with initial onset was collected from our hospital from September 2012 to July 2015， and 20 bone marrow samples from non-tumor patients was used as control samples. The expression level of SMYD3 gene was determined by real time quantitative PCR， and the relationship between SMYD3 gene and clinical features were analyzed. Result： The expression level of SMYD3 gene in newly diagnosed AML was significantly higher than that in the control group （P<0.001）; AML was divided into M3 group and non-M3 group， SMYD3 gene expression level of M3 group and non-M3 group was significantly higher than that of control group （P<0.001）; the expression level of SMYD3 gene in non-M3 group was higher than that in M3 group （P<0.05）， older than those of M3 group and control group （P<0.05）. Conclusion： SMYD3 is highly expressed in primary AML， it is an AML-related gene， non-M3 has higher SMYD3 expression levels than M3.

[Key words] SMYD3 Acute myeloid leukemia Gene expression

First-author’s address： Ningbo First Hospital， Ningbo 315010， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.29.006

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是常见的恶性肿瘤之一，发病率呈现逐年上升的趋势，其耐药率、复发率和死亡率居高不下，因此迫切需要寻找新的相关基因作为诊断、预后监测的新靶点。SET和MYD结构域蛋白3（SET and MYND domain-containing 3 protein，SMYD3）由東京大学医学院Hamamoto等[1]于2004年在肝癌及结肠癌中首次发现，在多种恶性肿瘤中呈现高表达，成为近几年肿瘤研究的新热潮。本研究前期的体外研究也证明沉默SMYD3基因后乳腺癌细胞侵袭性明显降低[2-4]。但是SMYD3在血液肿瘤中的报道较为少见，在AML中的研究迄今尚无报道。为探讨SMYD3基因在AML中的表达情况，本研究分析87例初发AML中的SMYD3表达情况，为AML的研究提供了新的思路，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源 选取2012年9月-2015年7月在本院就诊的初发AML骨髓样本87例为AML组，其中男53例，女34例;年龄15～87岁，中位49岁。AML的诊疗标准参考成人急性髓系白血病（非急性早幼粒细胞白血病）中国诊疗指南（2011年版）和急性早幼粒细胞白血病中国诊疗指南（2011年版）[5-6]。FAB分型：M0 1例，M1 3例，M2 3例，M3 38例，M4 24例，M5 18例。将初发AML的标本按FAB分型分为M3组（n=38）和非M3组（n=49）。对照组样本20例为非肿瘤患者骨髓。本研究已通过医院医学伦理委员会审批（2021-R039），获得患者或其家属的知情同意。

1.2 材料 TRIzol试剂和反转录试剂为赛默飞世尔科技（中国）有限公司产品。TB Green PCR试剂为宝日医生物技术（北京）有限公司产品。Ficoll细胞分离液为美国GE公司产品。实时荧光定量PCR仪为美国应用生物系统公司StepOne Plus。核酸蛋白检测仪为赛默飞世尔科技（中国）有限公司NANODROP 2000。

1.3 实验方法 （1）提取RNA：按骨髓样本2 mL︰Ficoll细胞分离液1 mL的比例，密度梯度离心法获取单个核细胞，按TRIzol试剂说明书提取mRNA，核酸蛋白检测仪检测mRNA浓度和纯度（A260/A280为1.8～2.0）。（2）cDNA合成：按反转录试剂说明书两步法合成cDNA，反应体系为20 μL。RNA

1 μg，随机引物1 μL，水补至12 μL，65 ℃，5 min，至冰上，加M-Mulv 1 μL，dNTP 2 μL，5×缓冲液4 μL，RNA酶抑制剂1 μL，42 ℃，60 min，70 ℃，5 min。（3）实时荧光定量PCR扩增SMYD3基因：引物序列（5’-3’）：SMYD3基因上游TGT GAC TGT TTC CGT TGC，下游 CAG AAC CTG CTC CCA CTT[2-4];内参基因GAPDH上游GAA GGT GAA GGT CGG AGT C，下游GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC。反应体系为20 μL：2×TB Green PCR混合液10 μL，

上下游引物各0.8 μL，50×ROX染料0.4 μL，cDNA 2 μL，水6 μL。扩增条件：95 ℃，30 s，1个循环;95 ℃，5 s，60 ℃，30 s（收集荧光信号），40个循环。SMYD3和GAPDH基因的扩增效率须在90%以上。扩增后增加熔解曲线步骤以确定扩增特异性。熔解曲线条件：95 ℃，15 s，60 ℃，60 s+

0.3 ℃（收集荧光信号），95 ℃，15 s。每孔样本的熔解曲线须仅见单峰，峰值在80～90 ℃。每个样本设3个复孔。每批次样本均以细胞株THP-1为内对照，并设阴阳性对照。（4）SMYD3基因表达量计算方法：以细胞株THP-1为内对照，2-∆∆Ct法计算SMYD3基因表达量。∆Ct=[CtSMYD3-CtGAPDH]样本-[CtSMYD3-CtGAPDH]内对照。因部分数据较小，SMYD3基因量以2-∆∆Ct×100表示。

1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0软件进行数据统计分析。计量资料呈非正态分布，以M（P25，P75）表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验;计数资料用频数或百分率表示，组间比较采用字2检验、连续校正字2检验或Fisher确切概率法。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AML组和对照组患者临床特征及SMYD3基因表达水平比较 两组年龄、性别比较，差异均无统计学意义（P>0.05）;AML组的SMYD3基因表达水平高于对照组，差异有统计学意义（P<0.001）。见表1。

2.2 非M3组、M3组和对照组的临床特征及SMYD3基因表达水平比较 非M3组的年龄大于M3组和对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）;M3组和对照组的年龄及三组的性别构成比较，差异均无统计学意义（P>0.05）;非M3组和M3组的SMYD3基因表达水平均高于对照组（P<0.001）;非M3组的SMYD3基因表达水平高于M3组（P<0.05）。见表2。

2.3 初发AML患者高表达水平组和低表达水平组的SMYD3基因表达水平和临床特征比

较 以SMYD3基因作为分类变量，将初发AML根据SMYD3中位表达数27.49分为高水平表达组（≥27.49，n=44）和低水平表达组（<27.49，n=43）。高水平表达组的SNYD3基因表达水平为39.67（34.00，56.44），低水平表达组为16.75（12.66，20.41）。两组的年龄、性别、白细胞计数、高白细胞（≥100×109/L）、红细胞计数、血红蛋白、血小板计数以及FAB分型比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表3。

2.4 非M3患者SMYD3基因表达水平和临床特征关系 以SMYD3基因作为分类变量，将初发AML（非M3）根据SMYD3中位表达数29.86分为高水平表达组（≥29.86，n=25）和低水平表达组（<29.86，n=24）。高水平表达组的SNYD3基因表达水平为49.26（37.26，101.84），低水平表达组为17.50（12.72，25.15）。两组的临床特征与SMYD3基因表达水平比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表4。

3 讨论

SMYD3是近几年备受关注的肿瘤相关基因，位于染色体1q44，是SMYD（含有SET和MYND结构域）家族蛋白中的重要成员[1]。国内外研究发现SMYD3不仅高表达于肝癌和结肠癌[1]，在乳腺癌[2-4]、肺癌[7]、前列腺癌[8]、胆囊癌[9]、胰腺癌[10]、卵巢癌[11]等各种实体肿瘤中也均呈现高表達。针对其作用机制的多方研究证实，SMYD3位于多条通路的关键位置，可接受多种上游基因的调节[12]，也可调节多种下游基因[13]，在促进癌细胞的生长增殖和侵袭转移中发挥不可或缺的作用。敲除SMYD3可恢复其所调节的基因的正常表达模式，从而阻止癌细胞不可控制的无限增殖[14]。本研究前期的体外实验也显示，SMYD3在乳腺癌细胞株上呈现高表达，microRNA沉默SMYD3后可通过Wnt/β-Catenin通路下调C-Myc基因表达，从而减弱乳腺癌细胞的生长和侵袭转移能力[2-4]。因此国内外研究者均认为SMYD3是表观遗传调控和信号通路的致癌驱动因子，靶向SMYD3的小分子抑制剂的开发是当前的研究趋势[15]。

SMYD3在血液肿瘤方面的研究相对实体肿瘤要少得多。文献[16]分析了59例慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL）中SMYD2和SMYD3的基因表达谱，发现两者在CLL患者中过表达，有残留表达的患者呈现高白细胞计数和复杂的染色体核型。文献[17]的研究对象为SMYD2基因，通过分析83例儿童急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）骨髓样本，证实了SMYD2基因在儿童ALL患者中的表达显著高于非肿瘤对照组，并且SMYD2高表达与較差的生存率相关，化疗缓解后SMYD2表达明显下降。由此可见SMYD3对血液肿瘤的发生发展的影响并不弱于实体肿瘤，在血液肿瘤领域研究SMYD3具有同样重要的意义。但迄今为止SMYD3在急性髓系白血病中的研究尚未见报道。本研究在AML标本中检测SMYD3的表达情况，为AML研究寻找新的分子指标。

本研究结果显示，非肿瘤对照组20例样本均存在低水平的SMYD3基因表达，提示SMYD3并非肿瘤特异性基因，它作为组蛋白甲基转移酶的一员，在多种生物过程如染色质形成、X染色体失活及转录调控中发挥重要功能[1]。而87例初发AML样本的SMYD3基因表达水平明显高于对照组，这与众多实体瘤和上述CLL及儿童ALL的报道一致，充分说明AML中也存在SMYD3的高表达。

在AML中，急性早幼粒细胞白血病（APL），FAB分型M3，是一种特殊类型，绝大多数患者具有特异性染色体易位t（15;17）（q22;q12），形成PML-RARα融合基因。近三十年来，由于全反式维甲酸及砷剂的规范化临床应用，APL已成为基本不用进行造血干细胞移植即可治愈的白血病[6]。国内外诊疗指南均将M3单独分析而与其他类型的AML区别开来。从成人急性髓系白血病（非急性早幼粒细胞白血病）诊疗指南可知，年龄≥60岁则是AML（非M3）的不良预后因素之一[5];急性早幼粒细胞白血病诊疗指南中提到M3易见于中青年，平均发病年龄为44岁，年龄并不是M3预后不良的判断因素[6]。可见年龄在AML（非M3）中是需要重点考虑的因素之一，而在M3中所占的比重要小得多。本研究通过将AML分为非M3组与M3组进行对比分析，发现M3作为一种特殊的AML类型，与AML（非M3）在SMYD3的表达水平和年龄上均存在差异：AML（非M3）比M3有更高的SMYD3表达水平和更高的年龄。

本研究结果显示，初发AML样本SMYD3基因中位表达水平为27.49，范围为3.68～182.48，SMYD3基因表达的异质性较大。因此本研究将SMYD3作为分类变量，以中位表达水平将AML样本分为SMYD3高水平表达组和低水平表达组进行比较，本研究将AML（含M3）和AML（非M3）均进行了高低水平的对比，但并未发现SMYD3表达量与年龄、性别、白细胞计数、高白细胞（≥100×109/L）、红细胞计数、血红蛋白、血小板计数以及FAB分型有相关性。

综上所述，本研究证实了SMYD3在AML中高表达，或许可以作为一种新的分子靶点应用于AML的诊断中。近几年，随着医学检测方法和诊疗水平的发展，国内外医学组织更多地采用遗传学变异和基因突变等来进行白血病的诊断、分型和危险度分层，患者也可以选择更多的检测方法来提高诊断的准确性和生存预测的精准性。因此本研究将在之后的实验中收集更多的病例和临床指标来分析SMYD3与白血病之间的相关性，并在此基础上进行患者的生存分析及作用机制研究，为白血病研究提供新的思路。

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（收稿日期：2021-09-09） （本文編辑：张爽）