荷花MADS—box基因的克隆及表达分析

王婧

摘要：采用RT-PCR方法从微山红莲花苞中克隆获得1个与花发育相关的MADS-box基因，命名为NeMADS1。该基因全长729 bp，包含1个720 bp的开放阅读框，编码239个氨基酸，具有典型的MADS结构域和K结构域。序列比对和系统进化分析结果表明，NeMADS1与E类家族AGL9/SEP-like3基因亲缘关系较近。RT-PCR分析结果表明，NeMADS1基因在花瓣、雄蕊和心皮中表达。

关键词：荷花；花发育；MADS-box；基因表达；RT-PCR

中图分类号： S682.320.1；Q785 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）01-0039-04

花发育的分子机理一直是植物分子生物学研究的热点，MADS-box基因家族作为转录因子，在花发育过程中起重要作用。MADS-box基因不仅参与花发育的调控，还在开花时间的控制、决定分生组织的分化[1]、促进根的形成[2]，以及种子和果实发育[3-4]等方面都起着重要的作用。

前人在对双子叶模式植物遗传突变体的研究中，提出了花器官发育ABCDE模型[5-10]。典型双子叶植物的花大多具有由外到内4轮结构：萼片、花瓣、雄蕊和心皮。模型认为控制花器官发育的基因按功能可以分成5类（A～E类功能基因），这些基因单独或共同作用控制各轮花器官的发育[9]。随着对拟南芥、矮牵牛、金鱼草等模式植物的研究，已经克隆到很多MADS-box基因，仅拟南芥中就有100多种MADS-box基因[11]。

SEP（SEPALLATA）基因属于MADS-box E类基因[9]，是花器官发育所必需的。拟南芥中有4个SEP基因：SEP1、SEP2、SEP3、SEP4（又称AGL2、AGL4、AGL9、AGL3）[12-15]，SEP1、SEP2、SEP4基因在拟南芥花发育的早期花分生组织中起始表达；而SEP3主要在内3轮花器官原基中表达。随着花原基的进一步发育，SEP1和SEP2在4轮花器官中均有表达[14]，而SEP3仅在花瓣、雄蕊和雌蕊中表达[8]，SEP4主要在萼片中表达[16]。目前为止，研究人员已从桃[17]、苹果[18]、草莓[19]、春兰[20]、文心兰[21]等多种植物中分离克隆了SEP-like同源基因，并且对其表达模型及功能开展了相关研究。

荷花（Nelumbo nucifera Gaertn.），别称莲花，是中国十大传统名花之一，具有很高的观赏价值。目前，有关荷花花器官发育MADS-box基因的研究报道较少，更未见AGL9/SEP-like基因的研究报道。本研究以微山红莲的花苞为试验材料，采用RT-PCR技术克隆获得1个荷花花器官发育 MADS-box家族E类相关基因NeMADS1的全长序列，并分析其表达模式，为莲科植物进化研究提供依据，同时为研究植物花发育模式以及荷花花器官发育的分子机理奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 植物材料

以吉林省经济管理干部学院基地的微山红莲为试验材料，于2015年8月取雌蕊分化后期花苞进行基因克隆。取盛花期花朵的萼片、花瓣、雄蕊、心皮进行RT-PCR表达分析。所有材料采集后均立即用液氮处理，于-80 ℃保存备用。

1.2 总RNA提取及cDNA合成

以雌蕊分化后期花苞为材料，采用十六烷基三甲基溴化铵法（CTAB法）提取其总RNA，用反转录试剂盒（SuperScriptTM Ⅲ Reverse Transcriptase， Invitrogen）合成cDNA，按照试剂盒说明书进行操作。

1.3 基因克隆与序列分析

查找NCBI中EST序列信息及相关资料设计引物扩增基因全长，引物序列NeS1-F：5′-CTGAAATGGGGAGAGGTAGGGT-3′、NeS1-R：5′-CTGATCATGCCAGCCACCCAGGC-3′，以荷花花苞的cDNA为模板进行基因全长PCR扩增。反应体系为25 μL，反应程序为94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，35个循环；72 ℃ 10 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测并回收目的片段，连接到pMD-19T（TAKARA）载体上，转化DH5α菌株，进行克隆、测序。引物合成和测序均由生工生物工程（上海）股份有限公司进行。

采用DNAMAN软件進行序列拼接和分析，获得的序列在NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）网站上进行Blast比对，用MEGA 5.0和ClustalX软件构建系统进化树。

1.4 RT-PCR表达分析

提取盛花期花萼、花瓣、雄蕊和心皮的总RNA并反转录成cDNA，进行RT-PCR表达分析。设计引物NeS1-F2：5′-AACAGGGCATTGAAACGG-3′，NeS1-R2：5′-AGCCACCCAGGCATATAAC-3′，定量PCR采用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ kit（TAKARA）。反应体系为：10 μL SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（2×）mix，0.8 μL forward primer，0.8 μL reverse primer，2 μL cDNA，0.4 μL Rox Reference Dye or Dye（50×），6.0 μL H2O。反应条件为：95 ℃ 5 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。以Actin为内参（Actin-F：5′-TGCCTATGTGGCTCTTGACTAT-3′，Actin-R：5′-GATGGCTGGAATAGAACCTCA-3′）在Roche Lignt Cycler 2.0荧光定量PCR仪上反应，3次重复，采用2-ΔΔCT法进行定量分析。

2 结果与分析

2.1 基因克隆与序列分析

以雌蕊分化后期的花苞总RNA反转录获得的cDNA为模板进行PCR扩增，分离出长度为729 bp的片段，NCBI上进行Blast比对分析，结果表明该片段与多种植物的MADS-box基因有较高同源性，证明该片段为所需目的片段。通过DNAMAN软件的序列拼接和分析，获得基因全长为720 bp，编码239个氨基酸（图1），命名为NeMADS1。

蛋白结构域分析结果表明，该蛋白是植物特有的MIKC型MADS-box基因，包含典型的MADS盒（实线部分）和K盒（双线部分）。Blast同源序列分析該基因与其他植物AGL9/SEP-like3基因具有较高的同源性。

2.2 NeMADS1氨基酸同源性比较

利用NCBI的BlastX工具将NeMADS1基因核酸序列翻译成氨基酸序列并进行同源性比对，结果表明：NeMADS1与ABCDE模型中的E类蛋白有较高的同源性，其中与EpSEP3、PaAGL9、EcAGL9和PtSEP3的同源性分别是87%、84%、84%、83%。对NeMADS1基因氨基酸序列的多序列比对结果表明：SEP-like基因编码氨基酸序列含有高度保守的5′端MADS结构域和半保守的K结构域，在差别较大3′端C-末端中发现了SEP-like蛋白特有的SEPⅠ和SEPⅡ基序结构域（图2）。

2.3 系统进化树分析

系统进化关系分析结果表明，NeMADS1编码蛋白与 ABCDE 模型中的AGL9/SEP-like3（E类）基因编码蛋白同源性较高，与领春木（Euptelea pleiosperma）的EpSEP3关系最近，说明NeMADS1应属于E类MADS-box基因（图3）。

A类和E类基因在进化上属于AP1/AGL9组，该组有3个进化系：AGL9（SEP）、AP1和介于二者之间的AGL6进化系[21-22]。为了确定NeMADS1的归类及进化关系，选取 AP1/AGL9 组MADS-box基因的氨基酸序列进行聚类分析。结果显示，AP1/AGL9组氨基酸序列明显分为3类：SEP、AP1和AGL6，其中AGL6与SEP分枝为姊妹关系，所有AGL9、SEP3聚在一起，然后又与SEP1/2/4聚在了一个大枝上（图3）。

2.4 RT-PCR表达分析

RT-PCR分析结果表明，NeMADS1基因在花瓣、雄蕊和心皮中表达量较高，尤其在花瓣中表达量最高，在花萼中表达量最低。NeMADS1基因的表达模式与拟南芥SEP3基因在各组织的表达模式一致，进一步说明NeMADS1属于E类基因（图4）。

3 讨论与结论

本试验采用RT-PCR技术克隆了与花发育相关的NeMADS1基因。同源性分析结果表明，NeMADS1基因与其他植物的AGL9/SEP-like3基因具有较高的同源性，其蛋白质包含MADS区、K区、I区和C-末端等4个区域，属于植物典型的MIKC类MADS-box基因。MADS-box蛋白的C-末端被认为与转录激活、高阶蛋白质复合体的形成、DNA特异性识别、亚细胞定位等有关[23]。SEP亚家族大部分成员的C端具有2个短的、相对保守的基序（SEPⅠ和SEPⅡ基序）[15]。NeMADS1基因具有保守的SEPⅠ和SEPⅡ基序，是典型的SEP-like基因。

通过对SEP-like基因的系统发育分析，发现SEP亚家族发生过多次基因重复事件，其中在被子植物起源之前发生了1次基因重复事件，产生了SEP3进化系和SEP1/2/4进化系[15]。本研究对NeMADS1基因系统进化树分析表明，所有的AGL9/SEP-like3聚在了一起，其中与领春木、昆栏树（Trochodendron aralioides）的关系较近， 而三者均属于基部双子叶植物，这个结果与APGⅢ分类系统一致，说明AGL9/SEP-like3基因在进化上相对保守，同时也为莲科在系统进化中所属的位置提供了证据。

荷花SEP-like基因NeMADS1在花瓣、雄蕊和心皮中表达，这与拟南芥SEP3基因、加州罂粟（Eschscholzia californica）EScaAGL9基因在表达模式上一致[15]，而与草原龙胆（Eustoma grandiflorum）EgSEP3-1基因的表达模式有所差异[24]。SEP作为花器官同源异型基因ABCD的共因子（co-factor）在各轮花器官决定中发挥作用[8]。事实上，各进化系的表达模式是存在差异的[25]，虽然E类基因的表达模式在被子植物不同的物种中有差异，但该基因对所有花器官的发育都是必需的，其功能是保守的。

本试验中分离出1个MADS-box基因家族E类基因，并对其功能进行了初步分析，有关其时空表达模式和深入功能分析工作也正在进行中，以期为阐明荷花花器官发育的分子调控机理奠定基础。

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