田蓟苷对缺氧/复氧损伤大鼠心肌细胞H9c2 的影响

李海宁，都研文，杨洁，热孜亚木.吾甫尔，于宁，邢建国

1.石河子大学，新疆 石河子 832000；2.新疆维吾尔自治区药物研究所，新疆 乌鲁木齐 830004；3.新疆医科大学，新疆 乌鲁木齐 830011

缺血性心脏病是临床常见的高死亡和高致残性疾病，近年来，随着临床预防的普及，以及介入、冠状动脉旁路移植术等治疗手段的发展，患者生存率有一定程度的提高，但随之而来的心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）引起患者心功能的较大损害。研究显示，再灌注引起的致死性损伤占心肌梗死面积的30%，目前针对MIRI心肌病尚无特效药[1-2]。香青兰Drococephalum moldivacaL.是新疆维吾尔族习用药食两用植物，主要用于治疗冠心病和高血压，其具有促进血液循环、改善心脏功能、治疗心肌缺血作用。田蓟苷（Tilianin）是从香青兰中提取的一种天然活性成分，属黄酮类化合物。前期研究表明，田蓟苷是抗MIRI 的主要活性物质，与普萘洛尔比较，较小剂量田蓟苷即具有同等作用，可降低心电图ST 段抬高幅度，改善心肌细胞肿胀、坏死、中性粒细胞浸润等病理现象[3-7]，但其作用机制还未完全阐明。肝X 受体α（LXR-α）是核受体家族具有抗MIRI 作用的LXR 亚型，是一种新的内源性保护因子，上调LXR-α 可增加促细胞存活的Akt 磷酸化、抑制促细胞凋亡的p38MAPK磷酸化，抑制细胞凋亡，缓解MIRI[8-14]。本实验以田蓟苷为研究对象，以H9c2 细胞缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）损伤为模型，从LXR-α 相关通路观察田蓟苷对心肌细胞的影响，探讨其体外抗MIRI 作用机制。

1 材料与方法

1.1 药物和细胞株

田蓟苷，新疆维吾尔自治区药物研究所，纯度98%，批号20171012。大鼠心肌细胞H9c2，中国科学院上海细胞库。

1.2 主要试剂与仪器

低糖DMEM 培养基（美国Hyclone 公司，货号SH30021.01），胰蛋白酶（美国Hyclone 公司，货号SH30042.01），无糖DMEM 培养基（美国Gibco 公司，货号11966-025），胎牛血清（美国Gibco 公司，货号10099-141），厌氧安宁包（日本MGC 公司，货号C-1），CCK-8 试剂盒（博士德生物工程有限公司，货号AR1160），活性氧（ROS）检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号CA1410），线粒体膜电位（JC-1）试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号M8650），Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒（美国BD 公司，货号556547），LXR-α（英国Abcam 公司，货号ab176323），p-p38MAPK（美国CST 公司，货号8690S，4511S），Akt、p-Akt（美国CST 公司，货号4691S、13038S），Bax（美国CST 公司，货号2772S），Bcl-2（英国Abcam 公司，货号ab59348），Caspase-3（美国CST 公司，货号9662S），GAPDH、HRP 标记山羊抗兔IgG、HRP 标记山羊抗大鼠IgG（北京中杉金桥公司，货号分别为TA-08、ZB-2301、ZB-2305）。电泳、转膜试剂（武汉博士德生物工程有限公司），ECL发光液（美国Millipore，货号WBKLS0100），EVOS FLoid 倒置荧光显微镜（Thermo Fisher 公司），多功能酶标仪（美国BioTek 公司），FACS Aria 型流式细胞仪（美国BD 公司），转移电泳仪槽（美国Bio-Rad公司），垂直电泳槽（美国Bio-Rad 公司），Allegra 64R冷冻高速离心机（美国Beckman 公司）。

1.3 细胞培养与分组

H9c2 细胞用含10%胎牛血清DMEM 低糖培养基，37 ℃、5%CO2培养，取对数生长期细胞进行实验。实验随机分为对照组、模型组和田蓟苷低、中、高剂量（5、10、20 μg/mL）组。

1.4 缺氧/复氧细胞模型建立

参照文献[15-17]方法操作，细胞用田蓟苷预处理3 h，换液为无糖无血清DMEM 培养基，置于放有厌氧安宁包的密封盒，缺氧6 h，弃去旧培养基，加含10%胎牛血清DMEM 低糖培养基，37 ℃、5%CO2培养进行复氧处理，复氧3 h，建立H/R 细胞模型。

1.5 细胞形态观察

取对数生长期细胞，以1×105个/mL 接种于6 孔板，每孔2 mL，培养24 h，弃去培养液，PBS 冲洗2 次，4%多聚甲醛固定20 min，镜下观察细胞形态。

1.6 细胞活力检测

取对数生长期细胞，以1×105个/mL 接种于96孔板，每孔100 μL，每组设6 个复孔，按照CCK-8检测试剂盒说明书测定细胞活力，于酶标仪波长450 nm 处检测各孔吸光度（OD 值），在不含细胞培养液中加入等量CCK-8 溶液，按相同方法测定吸光度作为对照，计算细胞存活率。细胞存活率（%）＝（实验孔OD 值－空白孔OD 值）÷（对照孔OD 值－空白孔OD 值）×100%。

1.7 细胞凋亡检测

取对数生长期细胞，以1×105个/mL 接种于6 孔板，弃去上清液，PBS 洗2 次，加250 μL 胰蛋白酶消化100 s，每孔加1 mL 含血清培养液终止消化，1000 r/min 离心5 min，PBS 洗2 次，离心，收集细胞，用400 μL Annexin V-Binding Buffer 重悬细胞，按照Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，利用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.8 活性氧检测细胞内

细胞处理同“1.7”项下方法，收集细胞，分别加入10μmol/L DCFH-DA工作液1mL，37℃避光孵育30min，弃去工作液，用不含胎牛血清的细胞培养液清洗3次，500 μL培养基重悬细胞，设置阴性和阳性对照，经流式检测细胞释放ROS 百分比。

1.9 细胞线粒体膜电位检测

细胞处理同“1.7”项下方法，收集细胞，每组加0.5mL 配制好的JC-1染色工作液，混匀后置于培养箱孵育20 min，1000 r/min离心3 min，并用配制好的JC-1染色缓冲液反复重悬洗涤细胞3次，除去未结合的多余染色液。再加入0.4mL JC-1染色缓冲液重悬细胞，过300目筛，经流式检测线粒体膜电位（MMP）变化，以红绿荧光之比判断MMP水平。

1.10 Westernblot 检测蛋白表达

H9c2细胞按“1.4”项下方法处理，冰上完成蛋白提取，裂解液按比例加蛋白酶、磷酸酶抑制剂。蛋白样品经BCA 法测定浓度，按比例加入蛋白上样缓冲液，金属浴95℃、5min变性。经SDS-双丙烯酰胺凝胶电泳后电转至PVDF膜。含5%脱脂牛奶TBST溶液封闭，加一抗LXR-α、p-p38MAPK、p-Akt、Akt、Bax、Bcl-2（1∶1000），4℃孵育过夜，次日用TBST摇洗3次×10 min，加HRP标记二抗（1∶2000），室温孵育2h，TBST 洗涤3次×10 min，ECL 成像系统采集图像，ImageJ 软件分析条带灰度值。

1.11 统计学方法

采用SPSS22.0统计软件进行分析。实验数据以表示，多组间比较采用方差分析，非配对t检验进行两组间比较，Bonferroni法进行校正。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 田蓟苷对缺氧/复氧损伤H9c2细胞形态的影响

对照组细胞数较多，形态完整，呈完整梭形，单层簇状生长；模型组细胞核皱缩，细胞变圆，漂浮于培养基上；田蓟苷各剂量组细胞形态有不同程度改善，其中田蓟苷中、高剂量组细胞密度略增加。见图1。

图1 各组H9c2细胞形态（标尺＝100μm）

2.2 田蓟苷对缺氧/复氧损伤H9c2细胞活力的影响

与对照组比较，模型组细胞存活率明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，田蓟苷各剂量组H9c2细胞存活率明显升高（P＜0.05），田蓟苷高剂量组升高最明显。结果见图2。

图2 各组H9c2细胞存活率比较（，n＝3）

2.3 田蓟苷对缺氧/复氧损伤H9c2细胞凋亡的影响

与对照组比较，模型组细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，田蓟苷中、高剂量组H9c2细胞凋亡率明显降低（P＜0.05），田蓟苷高剂量组降低最明显。结果见图3。

图3 各组H9c2 细胞凋亡率比较（，n＝3）

2.4 田蓟苷对缺氧/复氧损伤H9c2细胞活性氧水平的影响

与对照组比较，模型组ROS含量明显增加（P＜0.05）；与模型组比较，田蓟苷各剂量组H9c2细胞ROS 含量明显降低（P＜0.05）。结果见图4。

图4 各组H9c2细胞ROS含量比较（，n＝3）

2.5 田蓟苷对缺氧/复氧损伤H9c2细胞线粒体膜电位的影响

红色荧光JC-1 聚合物从线粒体基质释放到胞浆，呈单体状态，显示绿色荧光，红绿荧光之比降低，即MMP 明显降低。与模型组比较，田蓟苷各剂量组H9c2细胞红绿荧光之比明显升高（P＜0.05），田蓟苷高剂量组H9c2细胞MMP升高最明显。结果见图5。

2.6 田蓟苷达的影响对缺氧/复氧损伤H9c2细胞相关蛋白表

与对照组比较，模型组H9c2细胞LXR-α、p-Akt、Bcl-2蛋白表达明显降低，p-p38MAPK、Bax、Caspase-3蛋白表达明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，田蓟苷中、高剂量组H9c2细胞LXR-α、p-Akt、Bcl-2蛋白表达明显升高，p-p38MAPK、Bax、Caspase-3蛋白表达明显降低（P＜0.05）。结果见图6。

图5 各组H9c2细胞MMP 水平比较（，n＝3）

图6 各组H9c2细胞LXR-α、p-p38MAPK、p-Akt、Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白表达比较（，n＝3）

3 讨论

缺血再灌注损伤主要是氧供应的恢复和ROS爆发，氧化应激造成细胞结构损伤和线粒体功能代谢障碍，进而引起凋亡[18]。其病理变化是MIRI发病机制中的重要环节。因此，寻找可同时减少氧化损伤和MIRI诱导细胞凋亡的有效靶点及物是挽救受损心肌细胞的关键策略。

LXRs是机体抗MIRI 的重要防御因子。在心血管系统中LXR-α 对心肌缺血、动脉粥样硬化和心肌肥厚等病理生理过程均具有调控作用。研究显示，LXRs激动剂GW3695可减轻大鼠脑缺血/再灌注损伤[19]，Akt 在细胞存活和凋亡中起重要作用，MAPK通路是转导胞外信号至胞内效应的重要级联通路，LXR-α 可通过激活PI3K/Akt/eNOS途径改善内皮祖细胞功能及血管损伤后的内皮再生和修复[20]，白僵菌素抑制cAMP-PKA-CREB 信号传导并上调LXR-α 的表达，从而抑制p38MAPK[21]。此外，H/R 处理后，氧化应激状态被认为是启动细胞损伤的主要因素[22]。

基于以上机制，本研究采用体外培养大鼠心肌细胞H9c2，通过糖氧剥夺再复糖复氧建立H/R 模型。结果显示，模型组细胞ROS 含量高于对照组，表明建模成功。给予田蓟苷干预后，发现给药组细胞活力显著提升，ROS 含量减少，MMP 升高，同时细胞凋亡率降低，且呈剂量依赖性，表明田蓟苷对H/R 诱导H9c2 细胞具有显著的保护作用。本实验结果显示，田蓟苷可外源性激活LXR-α 蛋白，继而使Akt 磷酸化并抑制p-p38MAPK 及其通路下游Bax 的表达降低ROS 含量，提高MMP 并抑制心肌细胞凋亡。

综上，田蓟苷可能通过激活LXR-α/Akt 通路，调节p-p38MAPK 凋亡通路蛋白而发挥抑制线粒体介导的内源性细胞凋亡程序，保护心肌细胞。考虑到心肌H/R 损伤机制较为复杂，田蓟苷对LXR-α 及凋亡通路p-p38MAPK/p-Akt 上下游影响的具体机制尚不完全明确，今后将进一步深入研究。