基于分子对接结合靶标mRNA 表达的交泰丸镇静催眠药效物质及机制研究

韩洪翠，张艳玲，路芳，毕磊，黄运芳，马鹏凯，张玉杰

北京中医药大学中药学院，北京 102488

交泰丸是治疗失眠症的经典名方，由黄连、肉桂按10∶1 组成，具有交通心肾、镇静安神功效，用于心肾不交引起的惊悸、夜寐不安等症。目前，交泰丸研究多集中于药理、化学成分和临床等，且镇静催眠作用是研究较多的方向之一[1]，但由于交泰丸成分复杂，其镇静催眠药效物质及作用机制尚未完全明确。已知交泰丸可通过调节5-羟色胺（5-HT）、γ-氨基丁酸（GABAA）等中枢神经递质发挥镇静催眠作用[2-3]。因此，本实验采用分子对接技术，选取与中枢镇静催眠、降压等密切相关的3 个蛋白受体，即5-HT1A受体、GABAA 受体、多巴胺D3（DRD3）受体作为蛋白靶标，研究其与交泰丸主要成分小檗碱（BBR）、黄连碱（COP）、巴马汀（PAL）、表小檗碱（EBBR）、药根碱（JAT）的结合活性，同时结合蛋白mRNA 表达实验，探究交泰丸镇静催眠药效物质及其治疗失眠的分子作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

SPF 级4 周龄雄性昆明小鼠56 只，体质量18～20 g，斯贝福（北京）实验动物科技有限公司提供，动物许可证号SCXK（京）2011-0004。饲养于北京中医药大学SPF 级环境，12 h 光照/黑夜循环，温度25 ℃，湿度60%，自由摄食饮水。

1.2 药物与试剂

BBR、PAL 对照品（批号分别为713-8702、732-8701），中国食品药品检定研究院，纯度≥98%；COP、EBBR、JAT 对照品（批号分别为MUST-12111602、MUST-14101309、MUST-14090711），成都曼思特生物技术有限公司，纯度≥98%；对氯苯丙胺酸（PCPA），批号20131101-17，美国Sigma 公司；Trizol Reagent试剂、反转录试剂盒、荧光定量PCR 试剂，Invitrogen公司；DEPC 水，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；其他试剂均为分析纯。

1.3 仪器

Q-5000 型紫外分光光度计（Quwell 公司），WD-9413 型凝胶成像分析仪（北京六一仪器厂），DG-3D 型大型水平电泳槽、DG-Ⅲ型双稳数显电泳仪（北京东林昌盛生物科技有限责任公司），ABI PRISM 7500 型荧光定量PCR 仪（ABI 公司），3K18型离心机（美国Sigma公司），9600型普通PCR仪（ABI公司）。

2 实验方法

2.1 同源模建

5-HT1A受体同源模型多以2 种人β2 肾上腺素能受体[4]或牛视紫红质受体[5]（PDB 代码分别为2RH1、3D4S、1U19，http://www.rcsb.org）为模板建立，将5-HT1A受体序列（P08908，http://www.uniprot.org）分别与以上3 种蛋白晶体结构进行序列对比，选取同源性较高蛋白为模板蛋白。用Discovery Studio2016 软件同源模建，得到20个模型，选择PDF Total Energy、DOPE score 均最低的模型作为目标蛋白。通过Ramachandran Plot 和Profile-3D 对同源模建蛋白模型进行评估。

2.2 分子对接

2.2.1 小分子配体及受体准备

本实验根据3 种受体蛋白的性质选择临床阳性药作为参考配体，见表1。

表1 靶标及参考配体信息

用ChemOffice2019 软件获得阿米替林、巴比妥、BP-897 和5 种黄连生物碱小分子初始3D 结构，用Discovery Studio2016 软件进行配体准备及能量最小化，得到优化后配体。导入同源模建得到5-HT1A受体蛋白，并在PDB 库中下载GABAA 和DRD3 受体的晶体结构，去掉结构中水分子和原配体，补充非完整的氨基酸残基，为蛋白加氢等，得到优化后受体。

2.2.2 活性位点确定与分子对接

根据5-HT1A受体与7 个配体对接结果[4]，选择产生作用最多的ILE189 为活性氨基酸位点；GABAA受体α1 亚型（Gabra1）中PHE65 可决定配体亲和力，且相邻ARG67 可促进配体结合位点形成[6]，因此，选择与ARG65 相邻PHE62 氨基酸残基为GABAA 受体活性结合位点；根据模建DRD3 活性氨基酸位点ASP117[7]，选择位置相似、类型相同ASP110 氨基酸残基作为活性位点。基于以上活性氨基酸位点确定结合口袋，用Discovery Studio2016 软件Libdock 模块将3个受体分别与5 种黄连生物碱和对应的参考配体对接。

2.3 动物实验

2.3.1 造模及分组

小鼠适应性饲养1 周，随机分为对照组8 只和造模组48只。造模组腹腔注射PCPA（400mg/kg）混悬液，对照组注射等量生理盐水，连续2d，28～30 h观察小鼠行为[8]。造模组注射30h后白日活动量增加，无法入睡、摄食量减少、敏感性较强，表明造模成功。再分为模型组和5种黄连生物碱给药组各8只。

2.3.2 给药

造模第3 日，各给药组分别给予BBR、PAL、COP、EBBR 和JAT 5种黄连生物碱0.3g，分别用30mL生理盐水混匀灌胃，给药剂量100 mg/（kg.d），对照组和模型组给予等体积生理盐水灌胃，连续7 d。第7 日灌胃1h 后，断头处死，冰浴迅速取出全脑，液氮冷冻，置于-80℃冰箱保存。

2.3.3 qPCR 检测

Trizol提取小鼠脑组织总RNA。Q-5000紫外分光光度计测定其浓度及纯度，保证其纯度在1.7～2.0。取5μL RNA 溶液进行1%琼脂糖胶电泳，5 V/cm 电压电泳20 min，拍照，检测RNA完整性。然后以提取的总RNA 为模板，使用Invitrogen 反转录试剂盒进行cDNA的合成。PCR反应体系：cDNA 1μL，上游与下游引物各0.25μL，PCR 反应mix×（AmpliTaq Gold®FastDNA PolymeraseLD，10×buffer，SYBR®Green 1，dNTPs）12.5μL，灭菌水10.5μL，总反应体系25μL；反应条件：94℃预变性2min，94℃变性30 s，62℃退火30s，72℃延伸30s，共35次循环，72℃、10min 终止反应。采用2-ΔΔCt法对目的基因进行相对定量分析。引物均委托鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成，引物序列见表2。

表2 PCR 各基因引物序列

3 结果

3.1 5-羟色胺1A 受体模型建立

5-HT1A受体序列对比结果显示，2RH1和序列的同源性与相似性最高，见表3。因此，以2RH1为模板进行同源模建，选择可信度与质量最高的模型为目标蛋白（见图1）。Ramachandran 图评估结果（见图2）显示，psi-phi 构象不合理氨基酸（红色点）有4个，小于氨基酸总数5%，表明5-HT1A受体模型氨基酸二面角结构较合理。Profile-3D评估结果显示，模型Verify Score、Verify Expected Low Score和Verify Expected HighScore分别为108.59、190.252、85.6135，且Verify Score位于Verify Expected Low Score和Verify Expected High Score 之间，说明模型质量较高。

表3 5-HT1A 受体序列对比结果（%）

图1 5-HT1A 受体3D模型

图2 5-HT1A 受体Ramachandran图

3.2 分子对接结果

LibDock分子对接结果见表4。5种黄连生物碱与5-HT1A、GABAA、DRD3受体打分结果均较高，表明配体小分子与受体结合活性均较高，且其中EB BR 打分高于参考配体阿米替林，5种生物碱打分结果均高于参考配体巴比妥，显示中药小分子针对受体蛋白靶向治疗失眠的潜力，而参考配体BP-897作为DRD3受体激动剂，其打分结果高于5种黄连生物碱，表现了BP-897对DRD3受体的高亲和力。配体小分子与5-HT1A、GABAA、DRD3受体蛋白的分子对接二维平面图（见图3～图5）显示，各对接构象同受体蛋白氨基酸残基之间相互作用力。经统计，配体主要与5-HT1A受体氨基酸残基GLY237、THR236形成氢键，加强小分子与蛋白的结合，同时与ASP239和ARG227等氨基酸残基产生静电作用和疏水作用；配体主要与GABAA 受体氨基酸残基LYS66、ALA72等产生疏水作用，与氨基酸残基LEU70、LYS66等产生氢键作用，极少产生静电作用；配体与DRD3受体蛋白之间产生的非键相互作用主要为氢键作用和疏水作用，产生作用的主要氨基酸残基分别为SER192、VAL111和PHE346，只与氨基酸残基ASP110产生静电作用。

表4 LibDock 分子对接结果（分）

图3 各配体小分子与5-HT1A 受体相互作用二维平面图

图4 各配体小分子与GABAA受体相互作用二维平面图

图5 各配体小分子与DRD3受体相互作用二维平面图

3.3 qPCR 检测结果

与对照组比较，模型组小鼠脑组织5-HT1A、Gabra1和DRD3mRNA 表达显著下调（P＜0.01）；与模型组比较，COP组小鼠脑组织除DRD3mRNA表达上调不明显外，5-HT1A、Gabra1mRNA 表达显著上调（P＜0.05，P＜0.01），余4种生物碱组5-HT1A、Gabra1、DRD3mRNA 表达显著上调（P＜0.05，P＜0.01）。见表5。

表5 各组小鼠脑组织5-HT1A、Gabra1 和DRD3 mRNA 表达比较（）

表5 各组小鼠脑组织5-HT1A、Gabra1 和DRD3 mRNA 表达比较（）

注：与对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

4 讨论

失眠症属中医学“不寐”范畴，是由脏腑机能紊乱、气血亏虚、阴阳失调引起的，导致不能获得正常睡眠的一类病症。交泰丸是治疗心肾不交型失眠的常用基础方剂，前期研究发现，交泰丸透过血脑屏障的主要成分为黄连生物碱，且其在病理动物模型上表现出显著差异的脑分布特征[9]。由此推测，黄连生物碱可能是交泰丸镇静催眠的药效物质。

当今，计算机辅助药物设计（CADD）、分子烙印技术等已成为药物研发领域的一部分[10]。而分子对接技术作为CADD 受体的一种方法，可迅速且较精确地预测受体和配体结合模式，在研究中药有效成分的潜在靶标及作用机制方面有独特的优势[11]。近年随着医学研究的推进，发现多数中枢神经递质在调节睡眠-觉醒节律中发挥了重要的作用[12]。研究表明，交泰丸催眠的药理作用与其影响调节睡眠中枢神经递质肾上腺素和5-HT 释放有关[2]；交泰丸可增加PCPA模型大鼠GABAA 受体表达，从而发挥镇静催眠作用[3]；此外，作为中枢神经系统重要的儿茶酚胺类神经递质，多巴胺可通过其特异性受体，发挥影响学习记忆、调节“睡眠-觉醒”、参与认知与情感等多种复杂的生理功能，在多巴胺受体中D3 受体亲和力最高。因此，本实验选择5-HT1A、GABAA、DRD3 受体做为分子对接靶标，与交泰丸的5 种主要黄连生物碱及相应的参考配体进行分子对接打分，预测配体与受体之间的结合活性。结果显示，5-HT1A、GABAA、DRD3受体与配体之间打分结果均较高，结合5 种黄连生物碱与受体之间的结合活性，可看出结合活性较高的原小檗碱型生物碱为EBBR、BBR 和COP。

为进一步探究交泰丸镇静催眠的药效物质及其分子机制，本研究使用PCPA 建立失眠小鼠模型，通过测定小鼠脑组织5-HT1A、Gabra1 和DRD3 受体mRNA 的表达，评估交泰丸镇静催眠药效物质对中枢神经递质受体的影响。结果显示，除COP 组DRD3受体表达上调不明显外，5 种黄连生物碱均可显著上调5-HT1A、Gabra1 和DRD3 受体表达，其中上调作用较明显的生物碱为BBR、PAL 和JAT。结合分子对接与靶标蛋白mRNA 表达实验结果显示，小檗碱结合活性与分子作用强度均较高，而结合活性较高的EBBR 与COP 分子作用强度不高。造成此差异的原因可能是5 种黄连生物碱成分在生物体内跨血脑屏障转运能力不同，由于小分子化合物与血浆蛋白结合后不易透过血脑屏障，结合黄连生物碱进入脑中的含量差异[13]与其血浆蛋白结合率的差异[14]，可以看出BBR跨血脑屏障运输的能力强，而EBBR 与COP 不易透过血脑屏障；此外，3 种神经递质受体在小鼠脑组织分布差异也可能是导致2 个实验结果差异的原因之一。在交泰丸分子作用机制方面，5 种黄连生物碱对中枢神经递质受体的影响结果表明，原小檗碱型生物碱能提高5-HT1A、Gabra1、DRD3 受体mRNA 的表达，从而增加神经递质5-HT、GABAA、多巴胺与受体的结合，促进慢波睡眠形成[12]，抑制啮齿动物本能运动[15]，起到治疗失眠作用。

本研究选择已经证实的与中枢神经系统镇静催眠、降压等作用密切相关的3 种受体探究交泰丸镇静催眠药效物质及其治疗失眠的机制，表明原小檗碱型生物碱成分是交泰丸的镇静催眠药效物质，其中小檗碱作用最强，且可通过影响5-HT1A、Gabra1、DRD3等受体的表达治疗失眠，但由于黄连生物碱具有多靶点的特性，其机制有待进一步研究。