健脾清肠补肾方药物血清对破骨细胞凋亡途径的影响

张亚利，陈倩，戴彦成，2，张紫薇，唐志鹏

1.上海中医药大学附属龙华医院，上海中医药大学脾胃病研究所，上海 200032；2.上海中医药大学附属上海市中西医结合医院，上海 200082

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种常见的消化系统疾病，属炎性肠病范畴。研究显示，UC可影响患者骨骼及钙盐的沉积[1-3]。近年来，UC 并发骨质疏松症研究备受关注[4-5]。骨质疏松症是一种以骨量低下、骨微结构破坏为特征的全身性骨病，表现为骨脆性增加、易骨折，是UC 患者常见肠道外表现之一[6]。骨重建对维持骨骼完整性具有重要作用，其由成骨细胞骨形成和破骨细胞骨吸收共同协调完成，破骨细胞异常导致这种内稳态被打破。骨质疏松细胞学特征为破骨细胞的破骨活性强于成骨细胞的成骨活性，导致骨质逐渐被吸收。因此，破骨细胞凋亡直接影响骨吸收，从而影响骨重建过程。研究发现，骨质疏松症中破骨细胞凋亡受到抑制[7-9]。前期临床研究表明，健脾清肠方治疗UC 取得较好疗效[10-12]。健脾清肠补肾方是在健脾清肠方基础上的拓展方，本实验从破骨细胞凋亡机制入手，观察健脾清肠补肾方药物血清对成熟破骨细胞凋亡的影响，探讨其治疗UC并发骨质疏松症发挥药效的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 药物

健脾清肠补肾方（黄芪30 g，党参15 g，益智仁12 g，补骨脂9 g，马齿苋30 g，甘草6 g，木香6 g，地榆15 g），饮片由上海中医药大学附属龙华医院中药房提供。浸泡饮片，煎煮2 次，过滤药液，浓缩后浓度为含原药材1.23 g/mL，置于-20 ℃冰箱保存。

1.2 细胞

RAW264.7 细胞株来源于Abelson 鼠科白血病病毒诱导肿瘤，购于中国科学院上海生命科学研究院。

1.3 动物

雄性SD 大鼠，SPF 级，6 周龄，体质量（200±10）g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，动物许可证号SCXK（沪）2013-0017。饲养于上海中医药大学动物实验中心SPF 级动物房，温度（23±3）℃，相对湿度35%～45%，光照12 h，自由摄食饮水。

1.4 主要试剂与仪器

核因子-κB 受体活化因子配基（RANKL）、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF），R&D 公司，批号分别为315-11、315-02；Bcl-2 抗体、Bax 抗体，CST 公司，批号分别为2876、2772；TRAP 染色试剂盒，Sigma公司，批号387A；Annexin V-FITC 和碘化丙啶凋亡检测试剂盒，BD 公司，批号556420。低温离心机（Eppendorf 公司，5804R 型），Accuri C6 流式细胞仪（Becton-Dickinson），纯水仪（Heal Force 公司），垂直电泳仪（Bio-Rad 公司，PowerPac 型），全自动数码凝胶成像系统（G：Box Chemi XT4，Syngene 公司）。

1.5 药物血清制备

将实验大鼠随机分为2 组，每组5 只。健脾清肠补肾方组大鼠按15 mL/kg 给予健脾清肠补肾方煎剂灌胃，空白对照组给予等体积蒸馏水灌胃，2 次/d，连续3 d。末次给药后1 h，乙醚麻醉，腹主动脉取血，无菌离心管收集，4 ℃静置2 h，4 ℃、3000 r/min 离心15 min，混匀合并同组大鼠药物血清，56 ℃恒温水浴灭活30 min，0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌，冻存管分装，置于-80 ℃冰箱贮存备用。配制成终浓度分别为2.5%、5%、10%的健脾清肠补肾方药物血清培养液[终浓度（%）＝加入血清体积÷总体积×100%]，即低、中、高剂量健脾清肠补肾方。

1.6 RAW264.7 细胞形态学观察

将RAW264.7 细胞置于37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中，使用DMEM 完全培养液（含10%胎牛血清、100 U/L 青-链霉素和2.5 mg/mL 两性霉素B）培养，每1～2 d 更换1 次培养液。待细胞融合至70%，用细胞刮将贴壁的RAW264.7 细胞刮下，离心后取新鲜培养液重悬，轻柔吹打均匀，细胞按1∶4 传代。

1.7 破骨细胞诱导及鉴定

细胞经计数，将RAW264.7 细胞按1×104个/cm2的浓度接种于培养板，加入100 ng/mL RANKL 和10 ng/mL M-CSF 共同诱导其分化。培养6 d 后，破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色鉴定。加入临时配制的TRAP 染色液，将培养板置于37 ℃恒温箱，避光孵育1 h；再用苏木精复染3 min，PBS 冲洗3 次，倒置相差显微镜下观察及拍片。光镜观察TRAP 阳性多核（≥3 个）破骨细胞。

1.8 Annexin V/PI 双染色法检测破骨细胞凋亡

将破骨细胞接种于6 孔板，健脾清肠补肾方药物血清（2.5%、5%、10%）对诱导分化成熟的破骨细胞进行干预，正常血清培养为空白对照。按不同培养条件分别加入培养液培养2 d；将6 孔板中每孔细胞培养液吸出至15 mL 离心管，每孔再加入400 μL 胰蛋白酶消化3 min，1 mL 完全培养液终止消化，500 μL培养液洗孔1 次；将消化的细胞加入同一离心管，2000 r/min 离心5 min，弃上清液，用1 mL 预冷无菌PBS 洗细胞沉淀1 次，用PBS 轻轻重悬细胞并计数，调整细胞浓度为1×106个/mL；取100 μL 细胞悬液，加入5 μL Annexin V-FITC，轻轻混匀；室温避光孵育15 min。加入5 μL 碘化丙啶（PI）染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置5 min；加300 μL 结合液；用流式细胞仪进行检测，Annexin V-FITC 为绿色荧光，PI 为红色荧光。

1.9 Western blot 检测破骨细胞Bcl-2 和Bax 蛋白表达

按不同培养条件（空白对照组和健脾清肠补肾方低、中、高剂量组）培养细胞2 d；取干预后2×106个破骨细胞，弃培养液，PBS 清洗2 次；培养皿中加入100 μL 预冷的蛋白裂解液，置冰上10～20 min；细胞刮刮下细胞收集至EP 管，4 ℃、12 000 r/min 离心5 min，吸取上清液至另一新离心管；取少量上清液，用Bradford 检测试剂盒进行蛋白质定量；每个样品上样20 μg，经SDS-PAGE 分离后，转膜、封闭，加入TBST 稀释的Bcl-2 和Bax 一抗（1∶1000），4 ℃孵育过夜；TBST 洗膜后加入1∶2000 稀释的二抗，室温摇床上孵育2 h；TBST 洗膜；将PVDF 膜放入凝胶成像仪中调整位置和焦距，于PVDF 膜正面的目的条带上滴加ECL 发光剂（试剂A 液与试剂B 液等体积混匀），动态集成5～15 min 并拍照，用Gel-Pro 分析软件对条带进行定位和分析。

1.10 统计学方法

采用SPSS26.0 和GraphPad Prism8.0 统计软件进行分析。计量资料以表示，对所有数据进行正态性检验和方差齐性检验，对符合正态分布且方差齐的数据用方差分析，进行多组间比较，组间比较用LSD-t检验，不符合正态分布或方差不齐的数据用非参数检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 破骨细胞观察及鉴定结果

RAW264.7 细胞刚贴壁时呈类圆形；第2 日可见伸出的伪足、单核，极少数有2 个核；第3 日可见细胞开始发生融合，逐渐形成空泡样多核巨噬细胞；第5 日细胞可融合形成破骨样细胞。RAW264.7 细胞经RNAKL＋M-CSF 联合诱导培养4 d，可见少量TRAP染色阳性细胞，类圆形，体积比单核细胞大数倍；培养6 d，TRAP 染色阳性的细胞形状不规则，多核（≥3 个），体积大，直径可达50～100 μm，有伪足，可见囊泡，镜下细胞核呈紫蓝色，胞浆中TRAP 活性部位呈深红色颗粒。见图1。

2.2 健脾清肠补肾方对破骨细胞凋亡的影响

通过Annexin V/PI 双染色法染色，流式细胞仪检测细胞凋亡。结果显示，空白对照组破骨细胞早期凋亡率和总凋亡率分别为5.17%、6.68%，与空白对照组比较，健脾清肠补肾方各剂量组破骨细胞凋亡率均明显升高（P＜0.05），其中健脾清肠补肾方高剂量组最显著，分别为15.21%、17.82%。见图2、图3。

图2 破骨细胞Annexin V/PI 双标记法流式细胞图

图3 各组破骨细胞凋亡率比较（，n＝3）

2.3 健脾清肠补肾方对破骨细胞Bcl-2 和Bax 蛋白表达的影响

与空白对照组比较，健脾清肠补肾方各剂量组Bcl-2 蛋白表达均明显下调，Bax 蛋白表达均明显上调，Bcl-2/Bax 比值明显下降，差异均有统计学意义（P＜0.05），其中健脾清肠补肾方高剂量组变化最显著。见图4、图5。

图4 各组破骨细胞Bcl-2、Bax、Bcl-2/Bax 水平比较（，n＝3）

图5 各组破骨细胞Bcl-2 和Bax 蛋白免疫印迹图

3 讨论

UC 并发骨质疏松症可归属中医学“骨痹”范畴，感受外邪、饮食不节、情志失调及禀赋不足时，易致脾肾损伤，脾虚运化无力，痰湿内生，日久化热，致湿热、痰浊、瘀毒内生，与气血搏结，壅滞于肠道；肾虚则精亏，骨无所养。脾肾亏虚是UC 并发骨质疏松症发病的关键环节，湿热蕴结肠道是其重要病机。健脾清肠补肾方是本课题组针对UC 并发骨质疏松症创立的临床协定方剂，是在前期研究健脾清肠方基础上的拓展方，为健脾清肠方去白及、黄连，加益智仁、补骨脂，由黄芪、党参、益智仁、补骨脂、地榆、马齿苋、木香、甘草8 味药组成。方中黄芪、党参、益智仁、补骨脂健脾补肾，地榆、马齿苋清热凉血止痢，木香行气止痛，甘草调和诸药。全方标本兼治，共奏健脾清肠补肾之功。

正常成年人体内骨转换需通过成骨细胞和破骨细胞的分化、激活及凋亡保持平衡。骨质疏松症通常表现为骨质量和骨密度的降低，以及骨组织微结构的改变。

细胞凋亡又称程序性细胞死亡，是由英国阿伯丁大学病理学家Kerr 等[13]1972 年首次提出，其广泛存在于多细胞生物的各种器官和组织中。线粒体凋亡通路是经典的细胞凋亡途径之一。线粒体是细胞产生能量的重要细胞器，是细胞氧化磷酸化和呼吸链的中心，也是细胞凋亡的调控中心。死亡受体介导的信号、生长因子抑制剂等许多因素均能使线粒体功能损伤，从而诱导细胞发生凋亡。健脾清肠补肾方药物血清加入破骨细胞后，各剂量组破骨细胞凋亡率较空白对照组均显著升高，且与药物浓度呈正相关。提示健脾清肠补肾方可促进破骨细胞凋亡，高浓度健脾清肠补肾方药物血清作用最显著。

Bcl-2 家族是细胞凋亡的重要调控因子，由促凋亡和抗凋亡成员协同发挥作用。Bcl-2 可能通过干扰细胞色素C 的释放从而阻断Caspase 的激活，抑制细胞凋亡的发生；Bax 即Bcl-2 相关的X 蛋白，是Bcl-2家族中促凋亡的重要蛋白之一。Bcl-2 可与Bax 形成异二聚体。正常情况下，Bcl-2 和Bax 在细胞内保持相对平衡。当Bcl-2 相对含量高于Bax 时，促进Bcl-2/Bax 异二聚体的形成，抑制细胞凋亡；当Bax相对含量高于Bcl-2 时，则抑制Bcl-2/Bax 异二聚体的形成，从而促进细胞凋亡[14-16]。因此，这2 种蛋白在异二聚体中所占比例可影响对细胞凋亡的调控。本研究发现，健脾清肠补肾方药物血清可提高破骨细胞凋亡率，其机制可能是通过下调Bcl-2 蛋白的表达、上调Bax 蛋白的表达而导致Bcl-2/Bax 比值下降，从而促进细胞色素C 等促细胞凋亡因子向细胞质释放而发挥作用。健脾清肠补肾方低、中、高剂量组均可促进破骨细胞凋亡，其中以健脾清肠补肾方高剂量组最明显。

综上，健脾清肠补肾方药物血清可促进破骨细胞凋亡，其机制可能是通过线粒体凋亡途径而发挥作用，通过下调Bcl-2 蛋白的表达，上调Bax 蛋白的表达，从而促进破骨细胞凋亡。健脾清肠补肾方各剂量组均可促进成熟破骨细胞凋亡，其中以健脾清肠补肾方高剂量组最明显。