克罗恩病组织中泛素特异性蛋白酶14的表达水平及意义

许飞，高正军

克罗恩病是一种肠道炎症疾病，克罗恩病的发病诱因尚未完全掌握，近年来有关学者认为，其发病可能是由于多种因素相互作用所致：环境因素作用于遗传易感者，在肠道菌群参与下启动肠道异常免疫应答，最终引起免疫损伤和炎症过程；或者因为患者免疫调节紊乱和特异抗原的持续刺激，免疫炎症反应表现过度且难以自限[1-3]。克罗恩病变主要发生在小肠与结肠，呈节段分布，界限清晰，可呈现4种主要病理形式，即急性炎症、溃疡、狭窄、瘘管形成。诱发克罗恩病变产生的主要因素有环境、遗传、免疫等[4-5]。该病发病主要表现为腹痛、肠梗阻等，且病变位置随着病情的严重程度有所转移，反复发作[6]。近年来，国内报道克罗恩病患者不断增多，症状多样化，使得诊断较为困难，误诊率高，迄今尚无彻底治愈方法。有研究表明，去泛素特异性蛋白酶14(ubiquitin-specific protease 14，USP14)在多种炎症性及癌症疾病的预后效果较好[7]。泛素化是真核细胞重要的蛋白质翻译后修饰方式，最早是伴随着泛素-蛋白酶体途径被发现的。对维持细胞蛋白质稳定发挥至关重要的作用。USP14定位于细胞质/膜中，由近500个氨基酸构成，USP14含有一个N端UBL结构域，与USP14和蛋白酶体之间的结合有关[8]。目前关于USP14与克罗恩病关系的研究较少，本文旨在探讨克罗恩病组织中USP14的表达水平及意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性选择2015年1月至2018年1月空军军医大学第一附属医院消化内科就诊的克罗恩病患者106例，其中，男性62例，女性44例；年龄20～60岁，平均年龄(40.23±6.13)岁；内镜下疾病活动度轻度 27 例，中度 44 例，重度 35 例，克罗恩病的诊断符合《中国炎症性肠病组织病理诊断共识意见》；本次研究得到空军军医大学第一附属医院伦理委员会批准。

1.2 纳入标准和排除标准

纳入标准：①患者年龄在18岁以上；②接受结直肠镜检查；③首次就诊并接受治疗；④患者知情并签署同意书。⑤符合临床上关于克罗恩疾病(局限性回肠炎、局限性肠炎、节段性肠炎和肉芽肿性肠炎等)诊断标准者。

排除标准：①治疗前曾服用抗生素；②合并急性感染性疾病；③合并严重的心、肾功能疾病等；④合并其他免疫性疾病；⑤患有其他恶性肿瘤；⑥不配合检查及随访者。

1.3 蛋白免疫印记检测克罗恩病组织中USP14表达

取克罗恩病活动度轻度、中度、重度组织，滴加RIPA裂解液，提取总蛋白；用 BCA 蛋白定量试剂盒进行蛋白定量；电泳120 V 100 min，转膜200，mA 90 min；PBS洗膜，脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗，4 ℃孵育过夜；PBST 漂洗，加入二抗，室温孵育1 h；曝光显影，用 ImageJ 软件分析结果。

1.4 克罗恩病内镜下疾病活动度判定

克罗恩病简化内镜评分(SES-CD)评价疾病活动度[9]。SES-CD 将肠道分为末端回肠、右半结肠、横结肠、左半结肠和直肠 5 部分，每个部分从 4 个维度进行评价，即溃疡大小、溃疡面积、受累肠道面积及肠腔狭窄情况，任一维度的评分均为 0～3分，总分越高表示 CD 病情越严重。缓解：0～3 分、轻度：4～10 分、中度：11～19 分、重度：≥20 分。

1.5 随访及预后评价

通过复诊及电话随访等方式了解克罗恩病患者治疗后2年的预后情况。于克罗恩病患者出院后1个月开始随访，每月随访1次，了解克罗恩病相关并发症发生情况、是否接受手术治疗及克罗恩病相关死亡等。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 USP14在克罗恩病不同疾病活动度中的表达

USP14在克罗恩病活动度轻度中的表达(0.87±0.15)低于其在中度(1.82±0.27)、重度(2.40±0.35)中的表达，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)；中度患者USP14水平较重度患者明显降低，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

图1 USP14在克罗恩病活动度中的表达

2.2 克罗恩病患者SEC-CD的评分及与USP14相关性分析

克罗恩病患者的SEC-CD评分为(23.22±4.31)分，克罗恩病患者USP14的表达水平与SEC-CD评分呈正相关关系(r=0.835，P<0.001)，见图2。

图2 USP14水平与SEC-CD相关性分析

2.3 USP14表达与克罗恩病患者预后的关系

106例患者中有42例(39.62%)预后不良，其中4例(9.52%)并发肠瘘、3例(7.14%)并发复杂肛瘘、4例(9.52%)并发肠梗阻、3例(7.14%)并发腹腔脓肿、2例(4.76%)并发消化道大出血、25例(59.52%)行肠切除术、1例(2.38%)死亡。预后不良患者USP14水平(2.13±0.35)高于预后良好患者USP14水平(1.68±0.25)，组间比较差异有统计学意义(t=7.638，P<0.001)。

2.4 影响克罗恩病患者预后的相关因素

两组性别、年龄、病变部位、有无上消化道受累比较差异无统计学意义(P>0.05)；两组疾病行为、肛周病变、USP14表达水平的相比差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 影响该病患者预后的相关因素分析 [n(%)]

2.5 克罗恩病患者预后的多因素 Logistic 回归分析

将上述单因素中有统计学意义的纳入多因素Logistic回归分析中，其中疾病行为赋值(0=非狭窄非穿透型，1=狭窄型或穿透型)，肛周病变赋值(1=有，2=无)，USP14赋值(1=≤1.82，2=>1.82)，结果显示，非狭窄非穿透型与无肛周病变是影响克罗恩病患者预后的独立危险因素(P<0.05)，USP14≤1.82是独立保护因素(P<0.05)，见表2。

表2 该病患者预后的多因素分析

2.6 USP14对克罗恩病患者预后的价值

USP14判断克罗恩病患者预后的灵敏度为59.38%、特异度为90.47%，AUC面积为0.785，说明USP14对克罗恩病患者预后具有一定的预测价值，见图3。

图3 USP14对克罗恩病患者预后的价值

3 讨论

克罗恩病的发病率具有较高的地域差异性，该病在欧美国家的白种人中发病较多。但近年来，该病发病率在我国也呈逐渐增长趋势，且无年龄限制，男女发病率亦无明显差异。目前对于该病无法完全治愈且误诊率较高，因此对于克罗恩病的早期诊断至关重要[10-12]。本文研究克罗恩病组织中USP14的表达水平及意义以及对患者预后的影响，具体分析如下。

肠道黏膜屏障包括物理、生物等屏障，当机体的任一屏障损伤后，肠道稳态失衡，进而引发肠道疾病，肠道细胞的生长、死亡、繁殖三者间的平衡对于肠道稳态至关重要[13]。有研究提出USP14可能是通过调节炎性因子进而调控多种癌细胞的生物学行为[14]。USP14位于18号染色体，是靠近端粒处的功能基因，对机体生命过程具有重要作用。在真核细胞中，26S蛋白酶体是蛋白质降解的主要位点，哺乳动物细胞26S蛋白酶体中，USP14约占10%～ 20%。虽然只有一小部分的19S颗粒含有USP14，但细胞中绝大多数USP14都与蛋白酶体结合。USP14参与体内蛋白质降解的调控，参与恶性肿瘤进展；USP14是哺乳动物中高度保守的去泛素化酶，因其在多种疾病中的高表达和重要作用而受到越来越多的关注[15-18]。本研究采用蛋白印迹方法检测USP14在克罗恩病中的表达，发现其在轻度的克罗恩病中的表达低于中、高度，在中度克罗恩病中表达低于高度中表达。邢智远等[19]对结肠癌细胞进行研究发现，USP14在结肠细胞中为高表达，抑制其水平后，可促进结肠癌细胞的凋亡。刘蓉蓓[20]运用大鼠建立肠道炎症的模型进行实验，结果显示USP14表达增加后，小鼠的肠道炎症有所增加。本研究结果与上述研究结果相似，由此可看出，USP14水平与克罗恩病病情严重程度有关，进而推测USP14可能是通过调节肠黏膜等炎症反应来调控细胞的活性，从而参与克罗恩病的产生与发展。SES-CD量表是评价克罗恩病患者病情的权威指标，能够准确反映克罗恩病病情的严重程度[21]。本研究发现，USP14在克罗恩病中的水平与SES-CD评分呈正相关关系，这一结果也进一步证实了USP14参与克罗恩病的产生与发展。

近年来，有关国内外的报道均显示克罗恩病的发病率在逐年增加，该病可侵犯消化道的任何位置，症状多样化，诊断较为困难且其误诊率超高，接近80%[22-24]。因此，发现能早期判断克罗恩病的发生及预后的分子标记物一直是临床上亟待解决的难题。目前有关USP14与克罗恩病关系的文献较少，但多位学者经过研究已证实其参与多种肿瘤疾病的产生及发展[25]。本研究发现， 106例随访患者中有42例(39.62%)预后不良，且预后不良组患者USP14的水平高于预后良好组，并发现其疾病行为、有无肛周病变是影响其预后的关键因素，USP14在非狭窄非穿透型的表达高于狭窄型及穿透型，在有肛周病变中的表达高于无肛周病变，这与易礼智等[26]研究结果相似，该结果表明USP水平与克罗恩病预后密切相关，有助于克罗恩病患者预后的评估。本研究进一步构建了USP14评价克罗恩病患者预后的 ROC 曲线，结果显示AUC为0.785、灵敏度为59.38%、特异度为90.47%，表明USP14对克罗恩病患者的预后价值较高，但其特异度偏低。为进一步证实USP14的表达与克罗恩病患者预后的关系，本研究进行了单/多因素Logistic 回归分析，结果表明非狭窄非穿透型与无肛周病变是影响克罗恩病患者预后的独立危险因素(P<0.05)，USP14≤1.82是独立保护因素，这与张连花[27]的研究结果相似。USP14对于临床评估克罗恩病具有较好的诊断价值，可有效判断克罗恩病患者的预后情况及病情严重程度，为临床治疗提供有利依据。

综上所述，USP14在克罗恩病中为高表达，其水平增加提示克罗恩病患者的病情加重、预后风险增加，是克罗恩病临床诊断的重要指标。