双向电泳分离水稻叶片蛋白实验教学的探索

王琳 陆添宇 杨晓勤 王梦芝

[摘 要] 采用双向电泳法分离水稻叶片蛋白，比较和分析了考马斯亮蓝染色方法和硝酸银染色方法对扫描得到的双向电泳图谱的影响。通过改进水稻叶片蛋白的双向电泳分离方法，可以得到更清晰的双向电泳图谱。结果表明，改进后的硝酸银染色方法灵敏度更高，分离蛋白点更多且清晰。由此可知，改进的实验方法可以得到更为灵敏、清晰的双向电泳图谱，能更好地适应和促进双向电泳分离水稻叶片蛋白的实验教学工作。

[关键词] 实验教学;改进;双向电泳;叶片蛋白;水稻

[基金项目] 2018年度扬州大学动物科学专业国际化高水平人才研本一体化培养机制研究与构建（YZUJX2018—1A）

[作者简介] 王 琳（1978—），女，江苏徐州人，博士，扬州大学生物科学与技术学院讲师，主要从事植物逆境生理与分子生物学研究;王梦芝（1972—），女，江苏徐州人，博士，扬州大学动物科学与技术学院教授（通信作者），主要从事动物营养与饲料科学研究。

[中图分类号] G642.0   [文献标识码] A   [文章编号] 1674-9324（2021）51-0029-04    [收稿日期] 2021-05-16

对于来自全细胞、组织或生物体中包含几千种蛋白质的蛋白混合物的分离、检测和分析是蛋白质组分析的首要目标。1975年O’Farrel首先建立了等电聚焦/SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（IEF/SDS-PAGE）分离和分析蛋白质组分的技术。这一技术应用两种不同的分离原理，依据蛋白质的特性进行分离。第一种是依据蛋白质所带电荷量的不同，用等电点（PI）聚焦技术分离蛋白质;第二种是依据蛋白质分子量大小的差别，通过蛋白质与SDS形成复合物后，在聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移率的不同达到分离蛋白质的目的。双向电泳技术，特别是以固相pH梯度等电聚焦为第一向的双向电泳技术是当前分辨率最高且信息量最大的电泳技术。利用双向凝胶电泳可以对不同样品或同一细胞的不同状态的蛋白质表达图谱进行对比和分析。配合分析软件如PDQuest、Image Master 2D等，找出蛋白质表达量上的差异。同时，双向凝胶电泳的分辨率比较高，在应用固相pH梯度干胶条和窄pH梯度范围胶条等技术后，能够在一张凝胶上同时分离出几千个甚至上万个蛋白质点[1，2]。双向电泳具有结果直观、分辨率较高、信息量大、技术成熟等优点，因此该实验成为本科生生物化学实验中的基础性实验，是生物化学实验教学的重要内容。

在双向电泳中，为了获得分辨效果好和重复性好的双向电泳图谱，得到质量高的水稻叶片蛋白电泳分离效果，找出合适的染色方法很重要。笔者在使用传统的双向电泳分离水稻叶片蛋白实验[3，4]方法时发现，根据原来的染色方法分离的蛋白斑点较少且模糊。为了提高水稻叶片蛋白的双向电泳分离效果，本文对此进行了探讨。

一、实验材料与方法

（一）实验材料

本实验所用水稻籼稻93-11稻种为扬州大学农学院提供。

1.材料种植与取样。从5月中旬开始分期浸种，每期间隔10天，共7期，浸种时间为50～60小时，然后于烘箱中恒温33℃进行催芽2～3天，将已催好芽的种子置于室内常温下，时间为1天，然后将种子播于已做好的秧板中，约45天后将其移栽入塑料盆钵中，盆深65cm，盆底内径55cm，盆口内径65cm。每个品种10盆，每盆5穴，于正常条件下生长。定期施肥，并做好防虫防病和除草工作。在取样过程中，叶片保存在冰盒中，然后将叶片于液氮中进行固定，固定1天后取出叶片，放置于-80℃的冰箱中保存。

2.仪器。IPGphor电泳系统为Pharmacia公司的产品;Protein II垂直平板電泳槽、循环水浴箱为Bio-Rad公司的产品;清华紫光扫描仪为清华紫光总公司的产品;PDQUEST 7.2 2-D胶分析软件为Bio-Rad公司的产品;U-2000型紫外-可见分光光度计为日本HITACHI公司的产品;冷冻干燥离心机speedvac为Applied Biosystem公司的产品。

3.试剂。固相pH梯度干胶条（pH3-10 L，180mm×3mm×0.5mm ，以及pH3-10 L，235mm×3mm×0.5mm）、载体两性电解质（pH3-10）、IPG缓冲液、过硫酸铵、PMSF、β-巯基乙醇、考马斯亮蓝R-250染料等产品购自Pharmacia公司;丙烯酰胺、N，N’-亚甲基丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠（SDS）、尿素、甘油、丙基磺酸盐（CHAPS）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、甘氨酸等为Amersco公司的产品;二硫苏糖醇（DTT）、牛血清白蛋白（BSA）、蛋白质组级-胰蛋白酶、铁氰化钾[K3Fe（CN）6]、碘乙酰胺（ICH2CONH2）、三氟乙酸（TFA）、碳酸氢铵（NH4HCO3）、硫代硫酸钠（Na2S2O3）为Sigma公司的产品;四甲基乙二胺（TEMED）为SERVA公司的产品;低分子量标准蛋白质为上海伯奥生物制品公司的产品;冰乙酸、甲醇、乙腈（ACN）为国产分析纯和国产色谱纯;双蒸水由本实验室提供。

（二）方法

1.水稻叶片蛋白质提取。将保存在超低温冰箱中的叶片取出，取适量放入研钵中，于液氮中研磨至叶片成粉末状;放入50ml的离心管中，将样品按1∶3的比例加入溶液A（10%三氯乙酸〔TCA〕和0.07%β-巯基乙醇的预冷丙酮溶液），充分振荡，在-20℃下静置过夜，然后4℃，11000rpm离心20分钟，弃去上清，再加入溶液B（含0.07%β-巯基乙醇的冰预冷丙酮溶液）悬浮沉淀，充分振荡后，在-20℃下沉淀1小时，然后4℃，11000rpm离心15分钟，弃上清，重复两次，将最终得到的沉淀物真空冷冻干燥，干燥后的样品保存在-80℃的冰箱中备用。

2.蛋白质含量测定。蛋白质含量测定采用Bradford法：Bradford染色液为100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml的95%乙醇，加入100ml、85%（m/v）的磷酸，用水稀释至1000ml配制而成。试剂的最终浓度为0.01%考马斯亮蓝G-250，4.7%（m/v）和8.5%（m/v）的磷酸。染色液用滤纸过滤，保存于室温棕色瓶中，可使用数周，每次使用前先过滤。将BSA配制成浓度1mg/ml的溶液，取8支10ml的试管，1～6号试管分别加入10μl、20μl、30μl、40μl、50μl、60μl标准蛋白质溶液，不足60μl的用水补足至60μl，7号试管中加入60μl的蒸馏水，8号试管中加入蛋白质样品溶液6μl，用水补足至60μl，加入3ml的Bradford染色液，充分振荡混合，2分钟后于595nm测定光的吸收值，测定在1小时内完成。利用不同浓度BSA的蛋白质浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线，根据所测蛋白质样品的光吸收值算出1、2、3蛋白质样品的预处理。

分别称取一定量的水稻叶片冻干样品，溶于裂解液中（7mol/L尿素，2mol/L硫脲，4%CHAPS，2%IPG buffer 4-7，1%DTT），样品超声波处理5次，每次3～5秒，间隔3秒，于冰水中裂解30分钟，14000rpm离心20分钟，取上清，再离心，取上清，以充分去除杂质，获得的蛋白样品除了少量用作浓度测定外，其余进行分装，于-80℃保存。每次用之前，将分装的蛋白样品取出，在室温下解冻，根据所需总的蛋白质质量取一定体积的蛋白样品，分别加入相应的水化液（7mol/L尿素，2mol/L硫脲，2%CHAPS，0.4%DTT，0.5%IPG buffer pH4-7或pH3-10），终体积为350μl，再加入微量溴酚蓝振荡混匀，2000rpm离心1分钟，将含样品的水化液均匀地加到水化盘中。

3.电泳。（1）第一向固相pH梯度等电聚焦。第一向等电聚焦基本是按照双向电泳手册上的方法进行。取pH3-10L或pH4-7L，18cm干胶条，去掉保护膜，准备水化。把干胶条胶面朝下置于水化盘中水化，加入IPG覆盖液使整个IPG strip被覆盖。水化时间为10～12小时，温度20℃。取出水化好的胶条，胶面朝上置于持胶槽中，胶条正负极与持胶槽正负极要一致，并使胶条与持胶槽两端电极充分接触，加适量IPG覆盖液覆盖整个IPG strip。样品液有两种加入方式：水化前把样品液加入水化液中和水化完毕后再在胶条槽加样杯中加入样品液，我们一般采用前一种方式。等电聚焦结束后，取出胶条，加入平衡液A（6mol/L尿素，0.05mol/L Tris-HCI，2%SDS，30%甘油，0.1%DTT，0.002%溴酚蓝）振荡平衡15分钟，再换平衡液B（6mol/L尿素，0.5mol/L Tris-HCl，2%SDS，30%甘油，0.4%碘乙酰胺，0.002%溴酚蓝）振荡平衡15分钟，取出胶条轻轻润洗，并去除多余的平衡液，准备第二向电泳。（2）第二向电泳SDS-PAGE。第二向SDS-PAGE基本是按照双向电泳手册上的方法进行。采用分离胶浓度为12.5%的连续SDS-PAGE垂直平板电泳。将已平衡好的第一向胶条置于第二向凝胶的上方，排除气泡，使二者紧密接触。用1%的琼脂糖凝胶封固胶条，接通电源，以15℃循环水浴冷却。15mA/块胶恒流电泳30分钟，待溴酚蓝前沿移至分离胶中后，再增大电流至30mA/块胶，待溴酚蓝前沿距凝胶板底0.5～1cm处，终止电泳，剥胶后准备染色。（3）凝胶染色（常规考马斯亮蓝R-250染色）。电泳结束后，将凝胶浸泡在固定液中过夜，然后在CBB R-250染色液中染色3～4小时，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，中间更换脱色液2～3次，至背景颜色浅淡，蛋白质斑点清晰即可。或者用蒸馏水漂洗数次后，用煮沸的蒸馏水脱色至背景颜色浅淡，蛋白质斑点清晰。（4）胶的扫描和保存。扫描仪扫描胶图后，如果短暂保存，可以将胶放在终止液中，也可将凝胶从终止液中取出，用蒸馏水洗3次，每次5～10分钟，然后放入密封带，加1%的乙酸，在4℃下可保存数月。

（三）实验方法的改进

首先采用三氯乙酸—丙酮法提取水稻叶片蛋白，其次用Bradford法测定蛋白质的含量，最后通过双向分离水稻叶片蛋白进行第一向等电聚焦后，再进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。具体方法参照文献[5]等。

电泳结束后，凝胶改用硝酸银染色方法染色。将凝胶浸泡于固定液（40%无水乙醇，10%冰乙酸）中固定30分钟或过夜，倒去固定液，换敏化液（30%无水乙醇，0.2%硫代硫酸钠，6.8%的乙酸钠）敏化30分钟，倒去敏化液，以双蒸水洗3次，每次5分鐘，然后置于银染液（0.25%硝酸银）中染色20分钟，再次用双蒸水洗2次，每次1分钟，接着置于显色液（2.5%无水碳酸钠，0.04%甲醛）中至蛋白质斑点完全显现为止，倒去显色液，立即换终止液（1.5%乙二胺四乙酸二钠）停止显色，l0分钟后用双蒸水洗涤3次，每次5分钟，此时凝胶就可以进行扫描和分析了。

二、结果与分析

在双向电泳中，采用合适的染色方法可以得到令人满意的双向电泳图谱，提高重复性，并有利于后续的进一步分析。我们试验了2种常用于2-DE中的染色方法以比较其灵敏度。

从图1可以看出在2种染色方法中，硝酸银染色法灵敏度最高，可以观察到许多低峰度蛋白质斑点，传统考马斯亮蓝R-250染色法灵敏度最低，大多数低峰度蛋白质斑点无法显现。从图2可以看出相应位置的蛋白质斑点在采用硝酸银染色法的胶中最清晰。

三、讨论

染色方法对双向电泳图谱的清晰度有很大的影响。好的染色方法可以得到令人满意的双向电泳图谱，提高重复性，并有利于进一步分析。不好的染色方法会造成图谱不清晰、蛋白质斑点稀少等问题[6]。在本实验教学中，改进的染色方法更有利于获得蛋白数量多、背景清楚、灵敏度高的凝胶图像，更适合双向电泳分离水稻叶片蛋白的实验教学。

四、结语

本实验方法克服了双向电泳分离水稻叶片蛋白传统方法的不足，用硝酸银染色方法代替原来的考马斯亮蓝法，得到了更为灵敏、清晰的实验结果，促进了本科生的实验教学工作，同时有利于其他教师从中得到启发。

参考文献

[1]索慧英，郑密，卢晗，等.杨树叶片蛋白质双向电泳图谱的建立[J].林业科学研究，2020，33（2）：128-137.

[2]王小蓓，王秀静，李丽霞.潮间带大型海藻小珊瑚藻蛋白质提取方法及双向电泳体系优化[J].江苏农业科学，2020，48（9）：72-77.

[3]郭尧君.蛋白质电泳实验技术[M].2版.北京：科学出版社，2005：7-8.

[4]梁宋平.生物化学与分子生物学实验教程[M].北京：高等教育出版社，2003：21-22.

[5]王琳，范云峰，粱建生.双向电泳中不同样品裂解液对水稻叶片疏水蛋白溶解效果比较[J].江苏农业科学，2017，45（18）：54-56.

[6]沙伟，李雯煜，张丽丽，等.砂藓总蛋白质提取方法的选取及双向电泳体系的建立[J].基因组学与应用生物学，2020，39（6）：2659-2665.

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