大鼠全身体积描记检测系统的性能确认

张燕华郑智勇李海涛陈 凯

(山东省药学科学院,山东省化学药物重点实验室,济南 250101)

安全药理学(safety pharmacology)主要是研究药物在治疗范围内或以上的剂量时,潜在的不期望出现的对生理功能的不良影响,即观察药物对中枢神经系统、心血管系统和呼吸系统的影响[1]。呼吸系统实验作为安全药理学核心组合实验的一部分,经历了从麻醉动物到清醒动物,从模拟化信号到数字化信号的转变[2-4]。根据《药物安全药理学评价研究技术指导原则》和ICH S7A 的要求,目前国内公认的试验方法为采用全身体积描记法监测大鼠呼吸系统指标。根据国家食品药品监督管理局药品认证管理中心颁布的药物非临床研究质量管理规范认证标准检查要点中的要求,大鼠全身体积描记系统作为计算机化系统,使用前需进行操作和性能确认,安装确认(installation qualification,IQ)、操作确认(operational qualification,OQ)、性能确认(performance qualification,PQ)[5-6]。本研究通过给予SD 大鼠巴氯芬和氨茶碱对全身体积描记检测系统进行性能确认。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SD 大鼠,SPF 级,90 只,雌雄各半,6～8 周龄,雌性体重202～228 g,雄性体重238～262 g,均购自北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)2016-0011]。饲养于山东省药学科学院新药评价中心[SYXK(鲁)2018-0031],饲养间温度控制在20℃～26℃,湿度40%～70%,每小时换气次数:≥15次,100%全新风,光照为12 h 明暗交替。动物试验中涉及的动物所有操作程序符合3R 原则,已经得到山东省药学科学院新药评价中心实验动物管理和使用委员会的批准(IACUC-2019-104、IACUC-2020-R033)。

1.2 主要试剂与仪器

巴氯芬片,批号为TT599,每片含量为10 mg,生产单位为诺华制药;氨茶碱片,批号为1901196,规格为0.1 g:100 片,生产单位为山东新华制药股份有限公司。UW2200H 电子天平,日本岛津;全身体积描记检测系统,美国DSI 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组

采用SPSS 软件的随机区组设计分组方法,根据性别和体重,随机选择30 只动物(雌雄各半)分配到3 组,分别为空白对照组、巴氯芬组、氨茶碱组。每组10 只动物,雌雄各半。

1.3.2 给药

巴氯芬组给药剂量为30 mg/kg,氨茶碱组给药剂量为30 mg/kg。各组给药途径均为经口灌胃,给药体积均为10 mL/kg。

1.3.3 检测方法

给药开始前,在FinePointe 采集软件中对系统进行一键校准,并创建新的study,根据采集时长和间隔建立采集模板。将动物在给药前约60 min 放入全身体积描记箱中进行适应,并采集5 min 稳定的数据作为药前基础数据。给药时将动物暂时取出,给药后将动物立即放回全身体积描计箱,并采集给药后1 h、2 h、4 h 的数据,将药后各时间段前后各2 min 数据的平均值作为相应时间点的呼吸功能检测结果。

1.3.4 检测指标

呼吸频率(f),单位:bpm(次/分);潮气量(TVb),单位:mL;每分通气量(MVb),单位mL/min。

1.3.5 系统稳定性实验

在不同的时间选用不同的动物,给药剂量和检测方法不变,将以上实验步骤(1.3.1～1.3.3)重复2 次,将后两次的结果与第一次结果进行比较,以检验系统的稳定性。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 巴氯芬对SD 大鼠f、TVb、MVb 的影响

如图1 所示,给予30 mg/kg 的巴氯芬后,与空白对照组比较:给药后1 h、2 h 和4 h,大鼠的f 显著降低,变化率分别为33.9%、55.6%和21.7%,TVb显著升高,变化率分别为75%、136.4%和73.9%,其差异均具有时间相关性和统计学意义(P<0.05)。与空白对照组比较,MVb 变化不明显且无统计学差异(P>0.05)。

2.2 氨茶碱对SD 大鼠f、TVb、MVb 的影响

如图1 所示,给予30 mg/kg 的氨茶碱后,与空白对照组比较:给药后1 h、2 h 和4 h,大鼠的f 显著升高,变化率分别为216.5%、131.3%和22.6%,MVb 显著升高,变化率分别为186.7%、105.4%和49.9%,其差异均具有时间相关性和统计学意义(P<0.05)。与空白对照组比较,TVb 变化不明显且无统计学差异(P>0.05)。

2.3 系统稳定性实验结果

如图2 和图3 所示,两次重复实验结果均显示:与同期空白对照组比较,巴氯芬组给药后1 h、2 h和4 h,大鼠的f 显著降低,Tvb 显著升高,Mvb 变化不明显,氨茶碱组给药后1 h、2 h 和4 h,大鼠的f、Mvb 显著升高,Tvb 变化不明显,后两次结果的f、Tvb、Mvb 的变化趋势与第一次结果一致。

3 讨论

巴氯芬是γ-氨基丁酸的衍生物,临床作为解痉药主要用于肌肉痉挛状态的治疗,其主要作用机制可能为干扰兴奋性神经递质释放,抑制脊髓突触间的传导,对运动神经元产生抑制作用,产生缓解肌肉痉挛的疗效[7]。氨茶碱片是茶碱与乙二胺复盐,茶碱是药理作用的主要成分,具有松弛呼吸道平滑肌、增强膈肌收缩力的作用,有益于改善呼吸功能[8]。本研究通过全身体积描记法明确观察到SD大鼠给予巴氯芬后会导致呼吸频率减慢,给予氨茶碱后会导致呼吸频率加快,表明全身体积描记检测系统可以准确的检测到动物呼吸频率和潮气量的变化。这一结果与相关文献报道基本一致[5]。

采用相同的药物在不同的时间给予不同的动物,对以上试验进行了两次重复实验,结果f、Tvb、Mvb 的变化趋势与第一次结果一致,表明在不同的时间通过全身体积描记检测系统得出的数据具有较强的稳定性。进一步表明此系统更适用于包含多次实验的研究中。

全身体积描记检测系统为将动物放入全身体积描记箱内,使动物处于清醒、无束缚状态下,通过检测动物呼吸时引起的腔体内气压的改变测量其肺功能参数[9-10]。相对于用麻醉动物进行试验,这种无束缚的方式可排除动物因麻醉时间、麻醉深度、创伤应激等因素的干扰,同时增加受试物的检测灵敏度,使结果更客观、准确,更接近临床[11];全身体积描记法可长时间连续监测,所得数据更接近真实值,更能反映动物在正常自然的状态下的生理状况[12]。相比对于大动物遥测法用模拟信号测定呼吸系统指标,这种方式可排除动物因呼吸带位置的滑动或动物体位的改变造成的干扰,测得的大鼠呼吸指标更准确、更全面且数据更稳定,除了常规的呼吸频率和潮气量外还可以测定气道阻力等,且大鼠成本低廉,抓取操作容易方便[13]。

图1 巴氯芬、氨茶碱对大鼠f、TVb、MVb 的影响(第1 次结果)Note.Compared with the control group,∗P<0.05.Figure 1 Influence of baclofen and aminophylline on respiratory rate,tidal volume box and minute ventilation box of rats(The first data)

图2 巴氯芬、氨茶碱对大鼠f、TVb、MVb 的影响(第2 次结果)Note.Compared with the control group,∗P<0.05.Figure 2 Influence of baclofen and aminophylline on respiratory rate,tidal volume box and minute ventilation box of rats(The second data)

图3 巴氯芬、氨茶碱对大鼠f、TVb、MVb 的影响(第3 次结果)(,n=10)Note.Compared with the control group,∗P<0.05.Figure 3 Influence of baclofen and aminophylline on respiratory rate,tidal volume box and minute ventilation box of rats(The third data)

本研究表明,SD 大鼠给予巴氯芬和氨茶碱后,通过全身体积描记法可以有效的监测到大鼠呼吸功能指标的变化。此方法简便快捷、灵敏度高,数据稳定,可及时有效的监测SD 大鼠给予受试物后引起的呼吸功能指标的变化,本系统可以应用到非临床安全药理试验研究中。