罗格列酮对肺成纤维细胞增殖的影响

史方海陈忠仁

(海口市人民医院呼吸内科,海口 570208)

肺纤维化是肺慢性炎症的主要危害,例如慢性阻塞性肺疾病或哮喘,气道慢性炎症促使局部大量的促纤维化生长因子分泌[1],成纤维细胞增生并向肌原成纤维细胞分化,重塑气道,诱发肺脏间质纤维化,最终导致患者肺功能的损害,可见阻止成纤维细胞增生以及气道重建是干预肺慢性炎症肺功能危害的关键[2]。罗格列酮(rosiglitazone,RGZ)是过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ,PPARγ)激动剂,临床使用中发现RGZ 还具有具有抗炎、调节免疫的功效[3],有研究显示RGZ 可以抑制肺部炎症,发挥肺损伤保护作用[4-5]。p38 丝裂原活化蛋白激酶(p38mitogen-activated protein ki-nase,p38MAPK)通路是生物体内重要的信号转导通路,在成纤维细胞的增殖分化中也发挥着重要作用[6]。本研究观察了RGZ 对肺成纤维细胞增殖的影响,并探讨p38MAPK 通路在其中的作用。

1 材料和方法

1.1 实验细胞

人胚肺成纤维细胞株(human embryonic lung fibroblast,HELF)购自中国科学院上海细胞库。

1.2 主要试剂与仪器

RGZ 购自太极集团重庆涪陵制药厂;青霉素、链霉素、转化生长因子-β1(TGF-β1)、碘化丙啶(PI)购于美国Sigma 公司;胎牛血清购自杭州四季青生物技术材料研究所;胰蛋白酶、高糖DMEM 干粉培养基购自美国Gibco 公司;细胞计数试剂盒(CCK-8)购自北京全式金生物技术公司;蛋白裂解液、Bradford 蛋白定量试剂盒购自南京凯基生物技术公司;I 型胶原蛋白(Col I)、III 型胶原蛋白(Col III)、P-p38MAPK、p38MAPK 抗体购自美国Santa Cruz 公司;MK3 多功能酶标仪、细胞培养箱为美国Thermo Fisher 公司产品;流式细胞仪为美国Beckman Coulter 公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养和实验分组

HELF 细胞于37℃、5% CO2环境下,培养于10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 mg/mL 链霉素的DMEM 培养液中,细胞融合达80%～90%时胰酶消化传代。实验分为:对照组、TGF-β1 组、低剂量RGZ(2 mmol/L,LD-RGZ)组和高剂量RGZ(4 mmol/L,HD-RGZ)组[5]。对照组正常培养,TGF-β1 组培养液中加入TGF-β1 至终浓度为10 μmol/L,LDRGZ 和HD-RGZ 组培养液中加入10 μmol/L TGFβ1 后,再分别加入2 mmol/L 或4 mmol/L RGZ。

1.3.2 CCK-8 细胞增殖检测

对照组、TGF-β1 组、LD-RGZ 组和HD-RGZ 组细胞,4000 个细胞/孔接种于96 孔板,每组设6 个复孔,置于细胞培养箱24 h、24 h、72 h 后,按照试剂盒说明书每孔加入10 μL CCK-8 液,继续培养4 h后,测定波长450 nm 处吸光度值即OD450值。

1.3.3 细胞周期检测

对照组、TGF-β1 组、LD-RGZ 组和HD-RGZ 组细胞,1×105个细胞/孔接种于6 孔板,每组设6 个复孔,24 h 后胰酶消化收集细胞,迅速注入4℃70%冷乙醇中固定24 h,1000 r/min 离心5 min,PBS 缓冲液洗涤细胞3 次,加入10 μmol/L PI 置冰上待测,流式细胞仪完成检测,仪器自带Cell Quest 软件进行细胞周期分析。

1.3.4 Western blot 检测蛋白表达

对照组、TGF-β1 组、LD-RGZ 组和HD-RGZ 组细胞,1×105个细胞/孔接种于6 孔板,每组设6 个复孔,24 h 后胰酶消化收集细胞,1000 r/min 离心5 min,PBS 缓冲液洗涤细胞3 次,每个样品加入100 μL 蛋白裂解液,使用Bradford 蛋白定量试剂盒定量后,每个样品取10 μg 蛋白进行SDS-PAGE 凝胶电泳,转印蛋白至PVDF 膜,5%脱脂奶粉封闭PVDF膜2 h 后,加入一抗,4℃孵育过夜,换二抗孵育2 h,压片,显影,定影,用Image-J 软件对照内参GAPDH蛋白,计算目的蛋白Col I、Col III、P-p38MAPK 和p38MAPK 的相对灰度值。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0 统计软件分析,多组均数间比较使用方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RGZ 对HELF 细胞增殖的影响

对照组、TGF-β1 组、LD-RGZ 组和HD-RGZ组细胞在24 h、48 h 和72 h 时OD450值存在显著差异(P<0.05)。其中,24 h、48 h 和72 h 时HDRGZ 组OD450值显著低于LD-RGZ 组(P<0.05),LD-RGZ 组又显著低于TGF-β1 组(P<0.05)。见表1、图1。

2.2 RGZ 对HELF 细胞周期的影响

对照组、TGF-β1 组、LD-RGZ 组和HD-RGZ 组G1 期细胞分别占细胞周期的(91.23±6.32)%、(70.35± 4.14)%、(76.12 ± 4.38)% 和(82.35 ±5.16)%,各组间存在显著差异(P<0.05)。其中,HD-RGZ 组G1 期细胞比例显著高于LD-RGZ 组(P<0.05),LD-RGZ 组又显著高于TGF-β1 组(P<0.05)。见图2。

2.3 RGZ 对HELF 细胞Col I 和Col III 蛋白的影响

从表2 和图3 可见,对照组、TGF-β1 组、LDRGZ 组和HD-RGZ 组细胞Col I 和Col III 蛋白表达存在显著差异(P<0.01)。其中HD-RGZ 组Col I 和Col III 蛋白显著低于LD-RGZ 组(P<0.01),LDRGZ 组又显著低于TGF-β1 组(P<0.01)。

2.4 RGZ 对HELF 细胞p38MAPK 通路的影响

从表2 和图3 可见,对照组、TGF-β1 组、LDRGZ 组和HD-RGZ 组细胞p38MAPK 蛋白表达无显著性差异(P>0.05),而P-p38MAPK 蛋白表达存在显著性差异(P<0.01)。其中HD-RGZ 组Pp38MAPK 蛋白显著低于LD-RGZ 组(P<0.01),LDRGZ 组又显著低于TGF-β1 组(P<0.01)。

3 讨论

气道的慢性炎症导致间质成纤维细胞增殖,产生大量细胞外基质,重建气道是肺纤维的病理生理基础[7]。PPARγ 激动剂罗格列酮抑制炎性细胞浸润、分泌致炎因子,拮抗气道炎症已被大多数实验证实[8-9]。研究发现罗格列酮可以通过调控内皮素、一氧化氮等一些生物活性物质抑制心肌成纤维细胞增殖[10]。TGF-β1 是刺激成纤维细胞增殖的常用细胞因子,并且研究已证实了TGF-β1 的致纤维化功能[11],本研究显示HD-RGZ 组细胞增殖的OD450值显著低于LD-RGZ 组(P<0.05),LD-RGZ 组又显著低于TGF-β1 组,说明了RGZ 可以抑制TGFβ1 诱导的HELF 细胞增殖,而且随着RGZ 剂量的增加抑制活性也升高。细胞周期分析显示RGZ 主要将HELF 细胞阻滞于G0/G1 期,减少进入DNA合成期的细胞比例,上述结果说明了RGZ 可以计量依赖性的抑制TGF-β1 刺激的肺成纤维细胞增殖。

表1 四组细胞OD450值的比较(n=6)Table 1 Comparison of OD450values of four groups

图1 细胞增殖的CCK-8 分析Figure 1 CCK-8 analysis of cell proliferation

图2 四组细胞周期的流式细胞仪检测Figure 2 Flow cytometry detection of cell cycle in four groups

表2 四组细胞Col I、Col III、P-p38MAPK 和p38MAPK 蛋白的相对灰度值比较(n=6)Table 2 Comparison of relative gray values of Col I,col III,P-P38MAPK and p38MAPK proteins in four groups

图3 蛋白表达的Western blot 检测Figure 3 Western blot analysis of protein expression

p38MAPK 是机体内一条重要的细胞增殖通路,通过p38MAPK 蛋白磷酸化激活其丝裂原活化蛋白激酶,从而进一步激活其下游的靶基因,调控成纤维细胞增生和胶原的分泌,靶向p38MAPK 通路的研究显示可以拮抗间质纤维化[12],王芳等[13]的研究显示PPARγ 配体4i 可同过抑制MAPK 信号通路抑制小鼠巨噬细胞炎性细胞因子的产生,说明了PPARγ 可以调节MAPK 信号通路,金玲等[14]在乳腺癌的研究中发现罗格列酮可抑制p38 MAPK 信号通路中的磷酸激酶活性,阻止通路的级联激活,进一步拮抗乳腺癌细胞的迁移和侵袭,Nuwormegbe等[15]发现罗格列酮通过调节p38 MAPK 通路抑制人翼状胬肉成纤维细胞的纤维化反应。本研究结果显示HD-RGZ 组P-p38MAPK、Col I 和Col III 蛋白显著低于LD-RGZ 组(P<0.01),LD-RGZ 组又显著低于TGF-β1 组,说明了RGZ 可以剂量依赖性的抑制p38MAPK 蛋白磷酸化,阻碍了p38MAPK 通路的激活,进一步减低了成纤维细胞胶原蛋白的合成。p38 MAPK 信号通路调控激活可以刺激成纤维细胞增生,罗格列酮抑制成纤维细胞增殖可能与p38 MAPK 信号通路抑制相关,但罗格列酮抑制p38 MAPK 信号通路的详细机制还有待进一步的实验研究来阐明。

综上所述,本研究显示罗格列酮可以抑制p38MAPK 通路,从而抑制肺成纤维细胞增殖以及胶原的合成,罗格列酮是否可以用于抗肺间质纤维化的治疗还有待进一步的临床研究来探明。