基于NLRP3/caspase-1 研究电针刺激对脑卒中大鼠小胶质细胞形态转换及神经元凋亡的影响

邓寒冰 李春琴 张 粲 金祖敏

(1.海口市第三人民医院针灸理疗科,海口 571100;2.海南医学院附属第二医院针灸科,海口 571100;3.云南中医药大学推拿基础教研室,昆明 650500;4.贵州织金县中医院治未病科,贵州毕节 552100)

脑卒中属临床常见心脑血管疾病,致残率、复发率、致死率均较高[1],修复神经元、缓解小胶质细胞形态等可改善脑卒中[2]。电针刺激可缓解神经疼痛、促进受损神经功能[3],但具体机制尚未清楚。激活核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-bindingoligomerizationdomain-like receptor protein 3,NLRP3)/半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1(ccysteine aspartate proteolytic enzyme 1,caspase-1)通路可在组织损伤、器官功能障碍中发挥作用[4],抑制NLRP3/caspase-1 通路在小胶质细胞中可减缓炎症反应,从而缓解脊髓损伤处后肢运动功能[5],但尚未发现脑卒中中相关研究。本研究采用Longa 线栓法改良建立脑卒中大鼠模型,探究三种不同电针方法对脑卒中大鼠小胶质细胞、神经元的影响,观察是否均有影响,以期为临床上缓解脑卒中提供一定理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

60 只清洁级健康SD 大鼠、6～7 周龄,雌雄不限,购自河南省实验动物中心[SCXK(豫)2017-0001],饲养于海南省药品检验所[SYXK(琼)2016-0009]。体重(200±20)g,所有大鼠均在温度(25±1)℃、湿度(55±5)%、12 h/12 h(黑暗/光照)在实验动物中心常规饲养。本实验经本院伦理协会审核并通过(20170018),并按3R 原则给予人道的关怀。

1.2 主要试剂与仪器

尼氏染色液(北京索莱宝科技有限公司,批号:20180118);Tunel 细胞凋亡检测试剂盒(绿色荧光)(碧云天科技有限公司,批号:20170209);一抗Iba1(羊抗鼠)、ED-1(兔抗鼠)、NLRP3(兔抗鼠)、caspase-1(兔抗鼠)、pro-caspase-1(兔抗鼠)、内参GADPH(兔抗鼠)、二抗羊抗兔、Alaxa Fluor© 555抗羊荧光二抗、Alexa Fluor© 594 抗兔荧光二抗(英国abcam,批号:20180415、20170519、20160114、20180408、20180408、20160112、20170803、20180418、20160111);电针仪(四川科仪诚科技有限公司,型号:6805-D);蛋白凝胶成像仪(上海天能公司,型号:Tanon 3500/3500R)。

1.3 实验方法

1.3.1 实验动物建立脑卒中模型

48 只大鼠据参考文献[6]按照Longa 线栓法改良建立大鼠脑卒中模型,3% 戊巴比妥钠(0.5 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,大鼠右侧侧卧于手术台上,去左颈部鼠毛并用医用乙醇消毒,切开皮肤分离出左侧颈总动脉、颈外动脉并结扎。参考文献[7]分离颈内动脉,在颈内动脉与颈外动脉分叉膨大处切口,尼龙线插入颈内动脉切口端,长度20 mm,插线结束后尼龙线与颈内动脉结扎。伤口处和皮肤逐层缝合,并注射青霉素防止感染。术后2 h Longa 验证模型成功与否,其中1～3 分为建模成功,模型成功率100%。模型组大鼠随机分为4 组,模型组、阳陵泉+配穴组、关元组、照海+申脉组,每组12只;12 只健康大鼠不结扎、不切口不插线,其余步骤相同,对照称为假手术组。

1.3.2 电针刺激模型动物

大鼠建模3 d 阳陵泉+配穴组、关元组、照海+申脉组,参考《实验针灸学》[8]对实验动物阳陵泉+配穴、关元、照海+申脉针灸穴位处取穴电针刺激,将针灸针分别连接电针仪,电压2～4 V,频率2/100 Hz、脉冲宽度0.5 ms、疏波4 Hz,逐渐加大强度直至大鼠出现轻微颤抖为度,留针30 min,每天一次,7 d为一个疗程,连续进行两个疗程。模型组、假手术组不进行任何处理,饲养相同天数。

1.3.3 Longa 评分评价电针对脑卒中大鼠行为学的影响

Longa 评分法[6]评价大鼠模型成功和电刺激后评价大鼠神经损伤程度。

1.3.4 电针对脑卒中大鼠小胶质细胞的影响

实验结束后麻醉大鼠,每组随机取6 只,迅速处死大鼠,取全脑组织,4%多聚甲醛灌注固定,取脑组织损伤处切片(5 μm),免疫荧光染色小胶质细胞,Iba1(1 ∶500)和ED-1(1 ∶200)混合(1 ∶1)稀释,4℃过夜,添加抗羊(1 ∶1000)、抗兔(1 ∶200)荧光二抗混合液,室温孵育2 h,PBS 清洗,抗荧光猝灭液(含DAPI)封片后荧光显微镜下观察,其中Iba1 染色红色,代表小胶质细胞;ED-1 染色绿色,代表被激活的小胶质细胞。

1.3.5 电针对脑卒中大鼠神经元形态的影响

取1.3.4 中切片,尼氏染色观察神经元形态,石蜡切片梯度乙醇复染、二甲苯脱蜡、梯度乙醇浸润,切片进入A 液(cresyl violet stain)中56℃染色60 min,PBS 漂洗,置于B 液(Nissl differentiation)分色数秒至2 min 直至背景色接近无色,晾干,无水乙醇脱水,二甲苯透明,树胶封片,显微镜下观察神经元形态、尼氏小体情况。

1.3.6 Tunel 染色观察电针对脑卒中大鼠神经元凋亡的影响

取1.3.4 中切片脱蜡处理,滴加2%蛋白酶K室温孵育20 min,PBS 清洗后滴加50 μL Tunel 反应混合溶液,湿盒孵育60 min,抗荧光猝灭液(含DAPI)封片后荧光显微镜下观察,其中绿色荧光显示凋亡阳性细胞数量。

1.3.7 蛋白免疫印迹(Western blot)检测观察电针对脑卒中大鼠NLRP3、caspase-1、pro-caspase-1 蛋白的影响

其余大鼠麻醉后迅速处死,模型组部分取脑卒中组织,假手术组取脑组织相同部位,蛋白提取试剂盒提取总蛋白,每孔上样20 μL 测定样本中NLRP3、caspase-1、pro-caspase-1 蛋白水平,一抗NLRP3(1/100000)、pro-caspase-1(1/2000)、caspase-1(1/100000)、GADPH(1/5000),4℃孵育过夜;加入对应二抗,室温孵育1 h。DAB 显色试剂盒显色,蛋白凝胶成像仪拍照和定量分析。

1.4 统计学方法

统计学软件SPSS 25.0 进行数据分析,计量数据以平均数±标准差()描述,多组间比较用单因素方差分析,组间两两比较采用SNK-q法检验。当P<0.05 时,差异有统计学意义。

2 结果

2.1 电针对脑卒中大鼠行为学影响

与假手术组比较,模型组Longa 评分升高(P<0.05)。与模型组相比,阳陵泉+配穴组、关元组、照海+申脉组Longa 评分降低(P<0.05)。见图1。

图1 电针对脑卒中大鼠Longa 评分的影响Note.A,Sham operation group.B,Model group.C,Yanglingquan+acupoint matching group.D,Guanyuan group.E,Zhaohai+Shenmai group.Compared with the sham operation group,∗P<0.05.Compared with the model group,#P<0.05.Figure 1 Effect of electroacupuncture on Longa score of stroke rats

2.2 电针对脑卒中大鼠小胶质细胞的影响

假手术组小胶质细胞呈现“双极或单极”状态,伴随细长突起,细胞形状类似。模型组小胶质细胞突起明显增多,Iba1/ED-1 显著高于假手术组(P<0.05)。电针刺激后,阳陵泉+配穴组、关元组、照海+申脉组较模型组小胶质细胞形态逐渐恢复,突起逐渐恢复,Iba1/ED-1 显著低于模型组(P<0.05)。见图2。

2.3 电针对脑卒中大鼠神经元形态的影响

假手术组神经元形态规则,结构完整,细胞内可见丰富的尼氏小体。模型组神经元出现明显皱纹,形状不规则、染色较浅,尼氏小体数量显著少于假手术组(P<0.05)。电针刺激后,阳陵泉+配穴组、关元组、照海+申脉组较模型组神经形态有所改善,神经元形态较饱满,尼氏小体数量显著多于模型组(P<0.05)。见图3。

图2 电针对对脑卒中大鼠小胶质细胞Iba1/ED-1 的影响Note.A,Sham operation group.B,Model group.C,Yanglingquan+acupoint matching group.D,Guanyuan group.E,Zhaohai+Shenmai group.Arrows indicated prominent parts.Asterisks indicated normal nerve cells.Compared with the sham operation group,∗P<0.05.Compared with the model group,#P<0.05.Figure 2 Effect of electroacupuncture on Iba1/ED-1 of microglia in rats with stroke

2.4 电针对脑卒中大鼠脑组织NLRP3、caspase-1、pro-caspase-1 蛋白水平的影响

与假手术组相比,模型组脑组织中NLRP3、caspase-1、pro-caspase-1 蛋白水平升高(P<0.05)。电针刺激后,与模型组相比,阳陵泉+配穴组、关元组、照海+申脉组脑组织中NLRP3、caspase-1、procaspase-1 蛋白水平降低(P<0.05)。见图4。

2.5 电针对脑卒中大鼠神经元凋亡的影响

与假手术组相比,模型组Tunel 阳性细胞数升高(P<0.05)。电针刺激后,与模型组相比,阳陵泉+配穴组、关元组、照海+申脉组Tunel 阳性细胞数降低(P<0.05)。见图5。

图3 电针对脑卒中大鼠神经元形态的影响(尼氏染色)Note.A,Sham operation group.B,Model group.C,Yanglingquan+acupoint matching group.D,Guanyuan group.E,Zhaohai+Shenmai group.Compared with the sham operation group,∗P<0.05.Compared with the model group,#P<0.05.Figure 3 Effect of electroacupuncture on neuron morphology in stroke rats (Nissl staining)

图4 电针对脑卒中大鼠脑组织NLRP3、caspase-1、pro-caspase-1 蛋白水平的影响Note.A,Sham operation group.B,Model group.C,Yanglingquan+acupoint matching group.D,Guanyuan group.E,Zhaohai+Shenmai group.Compared with the sham operation group,∗P<0.05.Compared with the model group,#P<0.05.Figure 4 Effect of electroacupuncture on the levels of NLRP3,caspase-1 and pro-caspase-1 protein in brain tissue of stroke rats

图5 电针对脑卒中大鼠神经元凋亡的影响Note.A,Sham operation group.B,Model group.C,Yanglingquan+acupoint matching group.D,Guanyuan group.E,Zhaohai+Shenmai group.Green,Tunel positive cell number.Blue,DAPI(Tunel staining).Compared with the sham operation group,∗P<0.05.Compared with the model group,#P<0.05.Figure 5 Effect of electroacupuncture on neuron apoptosis in stroke rats

3 讨论

脑卒中可激活小胶质细胞,加快神经毒素的产生;可快速改变神经元活动和突触功能,改变本身作用,产生神经毒素和改变神经元功能均加重疾病[9-10],因此缓解小胶质细胞状态、减缓神经元凋亡可能缓解疾病。本文以Longa 线栓法改良建立缺血性脑卒中模型,研究发现建模后小胶质细胞细胞突起增多,Iba1/ED-1 升高;神经元出现形状不规则、明显皱纹、尼氏染色较浅现象,尼氏小体数量减少、Tunel 阳性细胞数升高,而尼氏小体正常情况下能被碱性染料染成蓝紫色,当神经元受到刺激时,尼氏小体数量减少,可反映神经元受刺激程度;Tunel阳性细胞数反映神经元凋亡数量,细胞数越多凋亡越严重。提示脑卒中模型中小胶质细胞被激活、突起改变,神经元刺激严重,出现凋亡现象,小胶质细胞原本结构破坏、神经元出现凋亡。

脑卒中中医属“中风”范畴,东汉张仲景提出“络脉空虚”,气血两虚、淤血阻络是病机之本,养阴益气、活血化瘀是治疗方案[11]。祖国医学认为,针灸是一种刺激,作用于腧穴,疏通经络、清淤散结、驱散阴寒,达回阳救逆、强身健体、预防疾病之功效[12]。本研究采用三种不同针刺方法探究对对脑卒中大鼠的影响,发现阳陵泉联合配穴、关元、照海联合申脉均可改善小胶质细胞形态和神经形态,同时使神经元由激活状态转化为正常状态,缓解神经元凋亡,从而改善脑卒中病情。

NLRP3 炎症小体被激活可直接与效应分子pro-caspase-1 结合形成炎症小体和成熟的caspase1,其中caspase1 可影响小胶质细胞和细胞凋亡从而影响疾病进程[13];激活caspase1 蛋白可引发细胞凋亡,严重时导致细胞死亡,加快急性和慢性脑部疾病发生发展[14]。本研究发现,与假手术组相比,模型组脑组织中NLRP3、caspase-1、pro-caspase-1 蛋白水平升高,提示脑卒中脑组织中NLRP3/caspase1 处于激活状态,可进一步激活小胶质细胞,从而改变小胶质细胞突触功能、促进神经元凋亡,影响疾病进程。而电针刺激后脑组织中NLRP3、caspase-1、pro-caspase-1 蛋白水平降低,可能电针刺激抑制NLRP3/caspase1 通路的激活,进而减弱通路对小胶质细胞和神经元的作用,从而减缓疾病。

综上所述,电针分别刺激脑卒中大鼠阳陵泉+配穴、关元、照海+申脉处,均可使小胶质细胞突起减少、形态逆转,神经元形态缓解、凋亡降低,可能是抑制NLRP3/caspase-1 通路实现的。但电针作用脑卒中大鼠机制复杂,也可能影响其他通路从而影响小胶质细胞、神经元,需在以后研究中进一步发现其机制,更加深入探讨其关系。