脐静脉内皮细胞外泌体对炎症因子刺激下前软骨细胞凋亡的影响

杨润泽，许文宁，郑火亮，蒋盛旦

上海交通大学医学院附属新华医院脊柱中心，上海200092

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是全球较常见的关节疾病。据报道，约10%的男性和13%的女性在60 岁以上会发生膝关节OA［1］。由于人口老龄化和肥胖症的增多，OA 的发病率也不断增加［2］。OA 患者常伴有关节软骨进行性破坏、关节积液、行动能力丧失等［3］。软骨细胞是软骨中唯一的细胞类型，在OA 发病过程中会发生多种变化，例如增殖和分泌能力的改变［4］。软骨细胞的异常凋亡、炎症反应等与OA 中软骨降解有关［5-6］。因此，探讨软骨细胞功能障碍的机制有助于OA 的诊断和治疗。OA常常伴随有不同程度炎症的发生，在其炎症发展的过程中，白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）发挥着重要的作用，可通过促进炎症介质前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）及一氧化氮（nitric oxide，NO）等的释放激活炎症反应［7］。外泌体作为细胞内吞过程中主动分泌的直径为50～100 nm的囊泡，具有脂质双层膜结构，可以从不同的细胞类型中释放，并已被证明在细胞通信中起到重要作用。外泌体可以在血液及关节滑液中稳定存在［8］。越来越多的证据［9］表明，外泌体参与OA、类风湿关节炎等关节疾病的发展。外泌体分泌或摄取失调可以导致急慢性炎症，继而引起软骨变性和关节破坏［10］。血管内皮细胞在人体内广泛分布，其分泌的外泌体对多种疾病的发生发展有重要作用，例如骨质疏松、糖尿病等［11-12］，但血管内皮细胞分泌的外泌体在OA中的作用未有详细报道。本研究利用IL-1β 刺激前软骨细胞建立OA 体外模型，探究血管内皮细胞分泌的外泌体对于OA的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

DMEM 高糖细胞培养液购自美国Hyclone公司，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国Gibco 公司，IL-1β 购自上海达科为生物技术公司，活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测试剂盒购自上海翊圣生物科技公司，RIPA 裂解液、BCA 试剂盒、电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）显影试剂、4%多聚甲醛固定液、Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒、C1090 一步法末端脱氧核糖核酸转移酶介导的dUTP 缺口末端标记法（TdT mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）细胞凋亡检测试剂盒、羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗购自上海碧云天生物技术公司，白细胞分化抗原9（cluster differentiation 9，CD9； 20597-1-AP）、 凋 亡 相 关 基 因2 互 作 蛋 白X（apoptosis linked gene-2-interacting protein X，Alix；12422-1-AP）、肿瘤易感基因101（tumor susceptibility gene 101，Tsg101；14497-1-AP）、裂解的半胱天冬酶3 （cleaved caspase-3，c-caspase-3；19677-1-AP）、B淋巴细胞瘤2（Bcell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2；12789-1-AP）、Bcl-2相关X 蛋 白（Bcl-2 associated X protein，Bax；50599-2-Ig）、Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap-1；10503-2-AP）、核因子E2 相关因子2（nuclear factor E2 related factor 2，Nrf-2；16396-1-AP）、βactin（66009-1-Ig）抗体购自中国Proteintech公司，血红素加氧酶1（heme oxygenase 1，HO-1；sc-390991）、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸醌氧化还原酶1（NADPH quinone oxidoreductase-like protein 1，NQO-1；sc-32793）抗体购自美国Santa Cruz 公司，总外泌体分离试剂盒购自美国Invitrogen公司。

1.2 细胞培养

人脐静脉内皮细胞 （human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）、小鼠前软骨细胞株ATDC5 购自ATCC 公司。细胞培养于完全培养基（DMEM 高糖培养液，含10% FBS、100 U/mL 青霉素、100 U/mL 链霉素）中，在37 ℃、5% CO2环境下常规培养，培养2～3 d根据细胞生长情况换液。其中HUVEC常规培养至细胞密度达80%以上时更换为无血清DMEM 高糖培养基，继续培养48 h后收集细胞培养液。

1.3 外泌体的分离与鉴定

1.3.1 外泌体分离方法 收集2×107个HUVEC 的培养液，按照试剂盒说明书分离外泌体。4 ℃、500×g 离心5 min 后收集上清液，4 ℃、2 000×g 离心1 h 后，丢弃沉淀，吸取上清液后，与一半体积的试剂盒中的外泌体提取液混匀后，4 ℃过夜。第2日，4 ℃、10 000×g离心1 h后，去除上清液，用1 mL 无菌磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）重悬沉淀，再次4 ℃、10 000×g 离心70 min 后，弃上清液，用200 μL PBS 溶解沉淀即可获得外泌体。

1.3.2 透射电镜观察外泌体形态 取新鲜提取的外泌体悬液10 μL，滴加到铜网上，室温过夜干燥后，使用乙酸双氧铀复染。随后透射电镜（美国Delong 公司）上机成像观察并拍照保存。

1.3.3 纳米颗粒跟踪分析 取100 μL外泌体悬液，用1×PBS 稀释10 倍后，置于比色皿中后放入粒度仪（新西兰Izon Science公司）中检测外泌体粒径分布。

1.3.4 Western blotting 检测外泌体标志物 向200 μL 外泌体悬液中加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液，冰上裂解30 min 后，4 ℃、12 000×g 离心10 min，取上清液。BCA 法测定蛋白浓度后。取适量5×十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）蛋白上样缓冲液，100 ℃煮10 min 后，冷却到室温。按照每孔20 μg 蛋白样品上样，设置80 V 电压电泳约30 min，调整电压到120 V，待溴酚蓝进入到凝胶底部终止电泳。选用PVDF 膜，湿转70 min，使用5%脱脂牛奶室温封闭1 h，一抗CD9（1∶1 000）、Alix （1∶1 000）、Tsg101（1∶1 000） 4 ℃孵育过夜。二抗（1∶2 000）室温孵育1 h，ECL 反应后，曝光显影并保存图像。

1.4 外泌体摄取实验

使用稀释后的PKH26 荧光染料（美国Sigma 公司），在避光条件下对20 μL 外泌体的磷脂双分子膜染色5 min后，加入等体积10%的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）终止染色后重悬外泌体沉淀。将染色后的外泌体加入到ATDC5 培养液中分别培养3 h 和6 h。待共培养结束后，去除细胞培养上清液后，PBS 清洗；加入4%多聚甲醛避光固定后，DAPI 染细胞核，再次PBS清洗；加入抗荧光淬灭剂，荧光显微镜（德国Leica 公司）观察拍照。

1.5 细胞分组及处理方法

将ATDC5 细胞分为空白对照（NC）组、IL-1β 组、IL-1β+50 μg 外泌体组、IL-1β+100 μg 外泌体组。除了NC 组外，每组均加入10 ng/mL IL-1β，模拟OA 体外模型；其中IL-1β+50 μg 外泌体组和IL-1β+100 μg 外泌体组，再分别加入50 μg及100 μg外泌体，作用24 h。

1.6 细胞内ROS水平检测

将ATDC5 细胞培养于6 孔板上，待细胞密度为60%～70%时，分别加入500 μL PBS、10 ng/mL IL-1β、10 ng/mL IL-1β+50 μg外泌体、10 ng/mL IL-1β+100 μg外泌体，作用24 h 后，弃细胞培养液，PBS 洗涤，加入2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（2'，7'-dichlorofluorescein-diacetate，DCFH-DA）荧光探针避光染色30 min，PBS 洗涤后荧光显微镜检测橙色荧光。

1.7 细胞凋亡检测

1.7.1 TUNEL 检测ATDC5 细胞凋亡 使用一步法TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡。ATDC5细胞按上述细胞处理方法处理完毕后，去除培养液，PBS 洗涤1次，4%多聚甲醛固定细胞30 min，PBS洗涤1次后加入免疫染色强力通透液室温孵育5 min。PBS 洗涤2 次，再加入配置好的TUNEL 检测液37 ℃避光孵育60 min，孵育结束后PBS 洗涤3 次，并使用DAPI 复染细胞核，荧光显微镜观察结果。

1.7.2 流式细胞术检测ATDC5细胞凋亡 ATDC5细胞按密度为6×105个/mL接种于6孔板，除空白对照（不进行任何处理） 和Annexin V-FITC 或碘化丙啶（propidium iodide，PI）单染外，细胞分为3组：正常对照组（Annexin V-FITC 和PI 双染）、10 ng/mL IL-1β 组、10 ng/mL IL-1β+100 μg 外泌体组。孵育24 h 后，PBS 洗涤2 次，0.25%胰酶消化，终止消化后，300×g离心5 min，收集细胞；用预冷的PBS重悬后再次离心弃上清液，加入200 μL结合缓冲液悬浮细胞，加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI 混匀，室温避光孵育15 min 后，流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司）检测细胞早期和晚期凋亡情况。

1.8 Western blotting 测定细胞中凋亡蛋白和抗氧化应激相关蛋白表达

按上述细胞处理方法分组干预24 h后收集细胞，PBS洗涤2 次，加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液，冰上裂解30 min 后，用细胞刮刀刮下裂解后的细胞，离心，提取细胞总蛋白，取10 μL 蛋白样品，利用BCA 法测蛋白浓度后，蛋白样品（20 μg 总蛋白）于12%SDS-PAGE凝胶上分离蛋白组分。一抗HO-1（1∶1 000）、NQO-1（1∶1 000）、Nrf-2 （1∶1 000）、Keap-1 （1∶1 000）、c-caspase-3 （1∶1 000）、Bcl-2 （1∶1 000）、Bax （1∶1 000），4 ℃孵育过夜，次日TBST 缓冲液漂洗后二抗（1∶2 000）室温孵育1 h，ECL 反应曝光显影后保存结果进行分析。

1.9 统计学分析

采用SPSS 20.0 软件对数据进行处理。定量资料以x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用独立样本t检验。P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HUVEC来源外泌体的结构特征

透射电镜下可以观察到HUVEC分泌的外泌体呈现脂质双层膜包绕形成的典型茶托状形态特征（图1A）。利用Western blotting 可检测到其蛋白标志物CD9、Alix 和Tsg101 的表达（图1B）。粒度分析检测表明，HUVEC 来源的外泌体粒径主要分布在100～200 nm（图1C）。

图1 HUVEC来源外泌体的鉴定Fig 1 Identification of HUVEC-derived exosomes

2.2 ATDC5细胞对HUVEC来源外泌体的摄取

荧光显微镜观察结果显示，被PKH26荧光染料标记的外泌体与ATDC5细胞共培养6 h后，外泌体可被ATDC5细胞成功摄取至细胞质中，并在细胞核周围聚集（图2）。

图2 荧光染料PKH26标记的外泌体与ATDC5细胞共培养3 h和6 h后的摄取情况Fig 2 Uptaking of PKH26-labeled exosomes co-cultured with ATDC5 cells for 3 h and 6 h

2.3 HUVEC 来源外泌体对于IL-1β 刺激下的ATDC5 细胞ROS生成的影响

与NC 组相比，10 ng/mL IL-1β 作用ATDC5 细胞24 h后，细胞内的ROS橙色荧光增强；同时加入50 μg外泌体和10 ng/mL IL-1β 刺激24 h 后，与单纯IL-1β 刺激相比，ATDC5细胞内ROS橙色荧光强度进一步增加（图3）。

图3 ATDC5细胞内ROS检测Fig 3 Detection of ROS in ATDC5 cells

2.4 HUVEC 来源外泌体对于IL-1β 刺激下ATDC5 细胞凋亡的影响

利用TUNEL 染色和流式细胞术检测ATDC5 细胞凋亡，TUNEL 染色结果显示：与NC 组相比，10 ng/mL IL-1β 刺激24 h 组细胞凋亡率升高，同时加入50 μg 外泌体后，ATDC5细胞凋亡率进一步升高（图4A、B）。流式细胞术检测结果也显示：与NC 组相比，10 ng/mL IL-1β 刺激24 h 组ATDC5 细胞总凋亡率升高，同时加入50 μg 外泌体后，ATDC5细胞总凋亡率进一步升高（图5A、B）

图4 TUNEL法检测ATDC5细胞凋亡Fig 4 Detection of apoptosis of ATDC5 cells by TUNEL assay

图5 流式细胞术检测ATDC5细胞凋亡Fig 5 Detection of apoptosis of ATDC5 cells by flow cytometry

2.5 HUVEC 来源外泌体对IL-1β 刺激下ATDC5 细胞凋亡和抗氧化应激相关蛋白表达的影响

Western blotting 检测结果显示，炎症因子IL-1β 处理ATDC5 细 胞24 h 的IL-1β 组，凋 亡 相 关 蛋 白Bax、c-caspase-3 表达量较NC 组明显上升，Bcl-2 表达量较NC组下降；而与IL-1β 组相比，IL-1β+50 μg 外泌体组和IL-1β+100 μg 外泌体组的Bax、c-caspase-3 表达量进一步上升，Bcl-2 的表达量逐渐下降（图6A）。按上述分组，抗氧化应激相关蛋白Nrf-2、HO-1、NQO-1的表达量逐渐下降，Keap-1表达量逐渐升高（图6B）。

图6 Western blotting检测ATDC5细胞中凋亡及抗氧化应激相关蛋白的表达Fig 6 Detection of the expression of apoptosis-and anti-oxidative stress-related proteins in ATDC5 cells by Western blotting

3 讨论

OA 常见于中老年人群，疾病进展到后期可对患者的生活质量和身心健康产生较大影响。软骨细胞主要存在于软骨基质中，被认为是参与OA 发生和发展的主要组分，其损伤和凋亡均会直接影响OA 的进程［13］。炎症因子IL-1β 已被证实参与OA 发病中软骨细胞的损伤变性［14］，故本研究使用IL-1β建立OA体外模型。

作为近年来研究热点之一的外泌体，起初被认为是细胞代谢的废弃物。后来研究［15］发现，其内容物多种多样，对细胞间信号转导起重要作用。研究［16］表明，多种细胞来源的外泌体对于骨缺损的修复有促进作用。作为体内分布广泛的血管内皮细胞，其分泌的外泌体对于OA是否有影响未见报道。

本研究拟探讨HUVEC 分泌的外泌体对于OA 是否有影响。使用试剂盒分离并鉴定外泌体后，通过荧光显微镜观察发现同时加入HUVEC来源的外泌体组比单独使用IL-1β 作用24 h 后的实验组，产生更多的ROS。既往研究［17］表明，由过多自由基（如ROS）引发的氧化应激是软骨降解和导致OA的主要原因，且氧化应激增多会导致细胞凋亡增多［18］。通过流式细胞术和TUNEL 染色观察发现NC 组、IL-1β 组、IL-1β+50 μg 外泌体组的ATDC5细胞凋亡率逐渐升高，说明HUVEC 来源外泌体对于IL-1β 刺激的ATDC5 细胞的凋亡有促进作用。据文献［19］报道，细胞的一些氧化应激反应依赖于Keap-1/Nrf-2/HO-1信号通路；通常情况下Keap-1与Nrf-2在细胞质中结合，这时处于未激活状态，若其一直未被激活，Nrf-2 会被泛素化进而被降解。在炎症、饥饿等条件刺激下，Keap-1与Nrf-2的结合变得不稳定，Nrf-2被释放出来，转移至细胞核，激活下游的过氧化物酶，从而起到抗氧化应激的作用［20］。根据既往研究［21-22］，一些物质例如微RNA、糖蛋白等可以通过影响Keap-1/Nrf-2/HO-1 通路以减轻氧化应激。因此，我们猜想HUVEC来源的外泌体可以通过影响Keap-1/Nrf-2/HO-1 通路，以加重氧化应激从而导致ATDC5 细胞凋亡。Western blotting、ROS 含量检测及细胞凋亡检测结果发现：HUVEC来源的外泌体使得ROS含量进一步增加，加重IL-1β 刺激ATDC5 细胞引起的细胞凋亡，同时Keap-1表达升高，Nrf-2、HO-1、NQO-1表达下降，即细胞抗氧化应激能力下降。但HUVEC来源外泌体对ATDC5 细胞的凋亡和抗氧化应激通路产生影响的具体机制，有待于更深入的研究。

综上所述，HUVEC 来源的外泌体可能通过影响Keap-1/Nrf-2/HO-1抗氧化应激信号通路从而增加IL-1β刺激下ATDC5 细胞内的ROS 产生，使得ATDC5 细胞凋亡增加。HUVEC 来源的外泌体对于OA 不能起到治疗性作用，且会加重软骨损伤程度，这为OA的诊治提供了新的思路。因此抑制HUVEC 来源外泌体的作用可能对OA 起到治疗性作用，而若要抑制某种外泌体的作用，需要进一步揭示其中发挥作用的具体分子，并针对具体分子进行靶向抑制，这为我们下一步的研究指明了方向。