基质金属蛋白酶响应性G4 PAMAM-IBU/GelMA水凝胶的构建及其特征研究

蔡传栋，王 非，崔文国，范存义，刘 珅

1.上海交通大学附属第六人民医院骨科，上海200233；2.上海交通大学医学院附属瑞金医院骨科，上海市伤骨科研究所，上海市中西医结合防治骨与关节病损重点实验室，上海200025

肌腱粘连是肌腱损伤及其修复术后的常见并发症，发病率可达60%，严重影响患者的肢体活动［1］。目前，肌腱粘连的治疗常常需要通过手术松解、切除粘连组织，但是术后仍有再次粘连的可能，进而形成“粘连-松解-再粘连”的恶性循环［2］。在松解治疗过程中，应用生物材料制成的防粘连膜包裹手术修复的肌腱，可以起到物理阻隔的作用，防治肌腱粘连；但是目前的生物材料防粘连膜作用单一、疗效较差且易引发炎症，限制其临床应用［3-4］。

非甾体类抗炎药（nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）可以通过抑制环氧合酶的活性，减少前列腺素2的合成，从而抑制局部白细胞的聚集，减轻炎症反应，进而达到抑制肌腱粘连的效果［5］。与罗非考昔等选择性环氧合酶-2抑制剂相比，作为NSAIDs之一的布洛芬（ibuprofen，IBU）能同时抑制环氧合酶-1 和环氧合酶-2，因而具有更好的抑制粘连的作用［6］。然而，肌腱损伤部位血供受到破坏，限制了IBU的全身用药；因此，局部使用IBU来减轻过度炎症反应，是防治肌腱粘连的一个重要方法。本课题组在前期研究中构建了载IBU防粘连膜，该膜能够减轻肌腱损伤修复过程中的炎症反应，提高防粘连效果［7］。但是该膜的IBU释放属于被动释放，不能按需精确释放药物；此外，IBU在水中的溶解度很低，限制了其在体液中的扩散，不利于IBU进入细胞［8］。因此，制备能够按需释放药物的防粘连膜，并提高IBU的溶解度，对于更好地发挥IBU抗炎、防粘连的作用尤为重要。

在防粘连膜的生物材料中，水凝胶可以有效地阻隔粘连组织，并可作为药物缓释的良好载体。水凝胶的微孔结构允许肌腱内外侧的营养物质交换，从而促进肌腱的内源性愈合［9］。近年来，生物敏感性可降解水凝胶作为一类既可用于生物治疗（载DNA、siRNA、蛋白质和多肽），又可用于药物释放的生物医用材料，日益受到人们的重视［10］。在肌腱粘连形成过程中，炎症阶段往往伴随着基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）含量的上调［11］，使得MMP 可以成为一个合适的引发药物响应释放的“触发器”。明胶（gelatin，Gel）是一类生物相容性较好的天然高分子［12］，分子链上有可被MMP水解的位点［13］；利用Gel 构建水凝胶材料可实现对疾病微环境响应性降解。基于此，本研究将IBU与第4代树枝状大分子聚酰胺-胺（generation 4 polyamindoamine，G4 PAMAM）结合后形成复合物（G4 PAMAM-IBU），包载于具有MMP 响应性的甲基丙烯酸酯明胶（methacrylate gelatin，GelMA）水凝胶中，从而形成按需给药的“疾病触发-药物释放-治疗疾病”的循环体系，然后研究该水凝胶对成纤维细胞增殖的影响，验证其防粘连作用，为防止肌腱粘连、控制炎症及促进患肢功能康复提供新的治疗方法及理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器

IBU（CAS 15687-27-1）、Gel（CAS 9000-70-8）、甲基丙烯酸酐［methacrylic anhydride（MA），CAS 760-93-0］、苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂盐［lithium phenyl-2，4，6-trimethylbenzoylphosphinate （LAP），CAS 85073-19-4］购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，G4 PAMAM购自威海晨源分子材料有限公司，透析袋（截留相对分子质量为1 000或3 500）购自上海源叶生物科技有限公司，MMP2（SRP3118）购自上海希格玛高技术有限公司，大鼠成纤维细胞208F购自上海生物化学与细胞生物学研究所，DMEM培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清（C0227）、CCK-8 试剂盒（C0037）购自上海碧云天生物技术公司，活/死细胞染色试剂盒（40747ES76/80）购自上海翊圣生物科技有限公司。紫外分光度光度计（Biospectrophotometer，AG6135）购自德国Eppendorf 公司，扫描电子显微镜（简称扫描电镜，Sirion 200）购自美国FEI公司，倒置荧光显微镜（TI2-U）购自日本Nikon公司，多功能酶标仪购自美国BioTek公司。

1.2 G4 PAMAM-IBU的制备与药物释放检测

准确称量2 mg IBU 粉末，溶解于1 mL G4 PAMAM溶液（2 mg/mL） 中，密封后超声振荡8 h 使IBU 与G4 PAMAM 形成G4 PAMAM-IBU。将所得溶液用蒸馏水将IBU稀释至3、6、9、12、18、24、30 μg/mL的浓度梯度。以紫外分光光度计检测其紫外吸收光谱并绘制G4 PAMAM-IBU 浓度- 吸光度值标准曲线。 将G4 PAMAM 配成不同浓度的水溶液，分别加入足够量的IBU，密封后超声振荡8 h，将所得溶液于4 ℃高速冷冻离心机中离心5 min（5 000×g），取上清液并再次离心5 min（5 000×g），此时上清液即为相应浓度G4 PAMAM的IBU 饱和溶液。以紫外分光光度计测定其吸光度值并用G4 PAMAM-IBU标准曲线计算IBU的饱和浓度。

将含IBU 2 mg/mL 的G4 PAMAM-IBU 溶液稀释至200 μg/mL，取稀释后溶液100 μL 加入透析袋（截留相对分子质量为1 000），之后将透析袋密封，置于20 mL去离子水中，于不同时间点取透析袋外液1 mL 测定紫外吸光度值，并重新补充1 mL 去离子水。根据所测得紫外吸光度值计算G4 PAMAM-IBU 的IBU 释放质量以及累计释放率。

1.3 G4 PAMAM-IBU/GelMA水凝胶的制备与特征检测

通过Gel 与MA 的加成反应合成甲基丙烯酸酯明胶（methacrylate gelatin，GelMA）。简言之，将10 g Gel 以10%质量分数溶于磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）中，缓慢加入5 mL MA，于60 ℃水浴锅中反应2 h，期间保持温度不变。待反应结束后，过滤溶液并放入透析袋（截留相对分子质量为3 500）中透析3 d。透析完成后冷冻干燥即可得到白色泡沫状的GelMA固体，将产物置于-20 ℃恒温冰箱中保存。

使用生物相容性较好的LAP 作为光引发剂。将GelMA、LAP 及G4 PAMAM-IBU 分 别 以5%、0.3% 及0.15%的质量分数溶解于去离子水中得到GelMA 预凝胶溶液，将此溶液暴露于365 nm 紫外光下15 s 即可得到载G4 PAMAM-IBU的GelMA水凝胶。

将所得100 μL 的水凝胶浸泡于0.1 μg/mL MMP2 溶液中48 h后取出，并与新制备的G4 PAMAM-IBU/GelMA水凝胶进行冷冻干燥。将冻干的水凝胶喷金后用加速电压5 kV 的扫描电镜观察被MMP 降解前后的G4 PAMAMIBU/GelMA水凝胶的内部微观形态。

1.4 G4 PAMAM-IBU/GelMA水凝胶的药物释放检测

取200 μL GelMA 预凝胶溶液，经紫外光交联后成胶。将所得水凝胶置入含2 mL 去离子水的透析袋中（截留相对分子质量为1 000），密封透析袋后放入18 mL 含0.1 μg/mL 的MMP2 溶液中，3 d 内于不同时间点取透析袋外液1 mL测定紫外吸光度值，并重新补充1 mL 0.1 μg/mL 的MMP2 溶液。根据所测得紫外吸光度值和IBU 浓度标准曲线计算G4 PAMAM-IBU/GelMA水凝胶中的IBU释放质量以及累计释放率。

1.5 细胞实验

1.5.1 G4 PAMAM-IBU 对细胞增殖的影响 用不同浓度的空白G4 PAMAM 培养基溶液培养细胞，观察其对细胞增殖的影响，并选择合适的浓度以排除其干扰作用。使用含10%胎牛血清的DMEM 培养基预先于96孔板中培养208F 细胞（2 000 个/孔），待细胞贴壁后更换为含不同浓度G4 PAMAM 的DMEM 培养基，并以继续使用DMEM培养的208F 细胞作为空白对照组。培养48 h 后，使用CCK-8试剂盒检测208F细胞的活力，操作按说明书进行。

选择合适的G4 PAMAM 浓度，制备G4 PAMAMIBU。用含10%胎牛血清的DMEM 培养基将G4 PAMAMIBU 按IBU 浓 度 分 别 配 置 为100、150、200、250、300 μg/mL 的含药培养基，培养已贴壁的208F 细胞；同时以含相同浓度IBU（以1%二甲基亚砜溶解）的DMEM培养基培养细胞作为对照。培养48 h 后，使用CCK-8 试剂盒检测细胞的活力。

1.5.2 G4 PAMAM-IBU/GelMA 水凝胶对细胞增殖的影响 将208F 细胞（10 000 个/孔）接种于24 孔Transwell细胞培养板下层，以含10%胎牛血清的DMEM 培养基进行培养。待细胞充分贴壁后，在Transwell 培养板上层放入200 μL 空白GelMA 水凝胶、载G4 PAMAM-IBU（G4 PAMAM 为1 mg/mL，IBU 为500 μg/mL） 或 单 独IBU（IBU 为500 μg/mL）的GelMA 水凝胶；并将3 种水凝胶分别浸于含0.1 μg/mL MMP2 的培养基（GelMA+MMP组、G4 PAMAM-IBU/GelMA+MMP 组和IBU/GelMA+MMP 组） 与不含MMP2 的培养基中（GelMA 组、G4 PAMAM-IBU/GelMA 组和IBU/GelMA 组）。将Transwell培养板上层没有水凝胶的细胞组设为对照组。

将 GelMA 组、 IBU/GelMA、 G4 PAMAM-IBU/GelMA 组、G4 PAMAM-IBU/GelMA+MMP 组 细 胞 于Transwell 细胞培养板中共培养48 h 后，移除上层小室，用PBS 充分洗涤细胞2 次，将配置好的活/死细胞染色溶液（将20 μL 钙黄绿素和40 μL 碘化丙啶加入10 mL PBS中并充分混匀） 250 μL 加入各孔中，室温避光孵育30 min 后吸除染色液并用PBS 洗涤细胞，通过倒置荧光显微镜观察。

将7 组细胞于Transwell 细胞培养板中共培养24 h 和72 h 后，移除上层小室，用PBS 洗涤细胞2 次，加入500 μL培养基和50 μL CCK-8试剂，放入37 ℃、5%CO2的培养箱中孵育2 h。随后用酶标仪检测在450 nm 下各孔的吸光度值。

1.6 统计学分析

所有实验数据均通过SPSS 25.0 软件进行分析统计，定量资料以x±s 表示，采用单因素方差分析比较组间差异，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IBU与G4 PAMAM的结合与解离特征

G4 PAMAM 表面的树枝状氨基可以与IBU 相结合（图1A）。通过紫外分光光度计测量纯IBU 在水中的溶解度以及IBU 与G4 PAMAM 结合后在水中的溶解度。室温下IBU 溶解度约为85 μg/mL；IBU 与G4 PAMAM 结合后，随着G4 PAMAM 浓度的增加，IBU 溶解度也随之增加，其中当G4 PAMAM 浓度为5 mg/mL 时，IBU 溶解度达到3 942 μg/mL，说明G4 PAMAM 与IBU 结合可提高IBU在水中的溶解度（图1B）。

通过透析袋释放试验对G4 PAMAM-IBU 的药物释放速度进行研究。分子量较小的IBU 可以通过透析袋进入外液，而分子量较大的G4 PAMAM 则被截留于袋中。在12 h 内，超过80%的IBU 与G4 PAMAM 解离，表明IBU与G4 PAMAM 结合后，由于IBU 的溶解度提高且被包裹在G4 PAMAM 内，可以逐渐释放至溶液中，较单纯溶解的IBU相比，可以发挥缓释作用（图1C）。

图1 IBU与G4 PAMAM的结合与解离表征Fig 1 Characterization of combination and dissociation of G4 PAMAM-IBU

2.2 MMP 响应性G4 PAMAM-IBU/GelMA 水凝胶的特征

GelMA 分子链上含有可被MMP 特异性水解的位点，因此被MMP处理后，GelMA水凝胶结构会逐渐降解（图2A）。G4 PAMAM-IBU/GelMA 水凝胶与GelMA 水凝胶冷冻干燥后经扫描电镜观察，2种水凝胶在微观结构上没有明显差别；经MMP 处理后，2 种水凝胶孔隙均增大，表明水凝胶在MMP的作用下发生了降解（图2B）。

为了研究MMP 是否可以加速G4 PAMAM-IBU/GelMA 水凝胶中IBU 的释放，我们对该水凝胶的药物释放行为进行了观察。将该水凝胶置于透析袋中，所释放的IBU 通过透析袋进入外液，未被释放的G4 PAMAMIBU 仍在袋内的水凝胶中。与未添加MMP 相比，添加MMP 可以明显加速水凝胶中IBU 的释放，在72 h 内即可完成超过70% 的药物释放， 说明MMP 可加速G4 PAMAM-IBU/GelMA水凝胶中IBU的释放（图2C）。

2.3 G4 PAMAM-IBU对成纤维细胞增殖的影响

图2 MMP所致GelMA水凝胶的降解及G4 PAMAM-IBU/GelMA水凝胶中IBU的响应性释放Fig 2 MMP-induced GelMA hydrogel degradation and MMP-responsive IBU release from G4 PAMAM-IBU/GelMA hydrogel

要研究G4 PAMAM-IBU 对细胞增殖的抑制能力，首先要排除G4 PAMAM 对细胞增殖的干扰。采用不同浓度的G4 PAMAM孵育细胞48 h后，随着G4 PAMAM浓度的增加，其对细胞抑制增殖效果也随之上升。当G4 PAMAM 浓度为100 和200 μg/mL 时，其抑制增殖效果与对照组（0 μg/mL）相比差异无统计学意义（均P>0.05）；当浓度达到300 μg/mL 以上，G4 PAMAM 开始显现抑制增殖的作用（均P<0.05）（图3A）。因此选用200 μg/mL G4 PAMAM进行后续实验。

与相同浓度的IBU 相比，与G4 PAMAM 结合的IBU抑制细胞增殖的作用显著提高。与空白对照组相比，单纯的IBU浓度需达到300 μg/mL才具有抑制细胞增殖的能力，而G4 PAMAM-IBU 中IBU 的浓度为100 μg/mL 时就可明显抑制成纤维细胞增殖（图3B）。

图3 G4 PAMAM与G4 PAMAM-IBU对成纤维细胞增殖的抑制作用Fig 3 Inhibitory effects of G4 PAMAM and G4 PAMAM-IBU on cell proliferation

2.4 G4 PAMAM-IBU/GelMA 水凝胶对成纤维细胞增殖的影响

水凝胶与成纤维细胞共培养48 h 后，GelMA 组细胞情况良好，活细胞多，几乎未见死细胞，说明GelMA 水凝胶的生物相容性较好。与IBU/GelMA 组相比，G4 PAMAM-IBU/GelMA 组活细胞数量减少，死细胞数量增多；G4 PAMAM-IBU/GelMA 组添加MMP 后，活细胞数量进一步减少，死细胞数量进一步增多（图4A），说明G4 PAMAM-IBU 的抑制细胞增殖的效果优于单纯IBU，且加入MMP 会促进G4 PAMAM-IBU/GelMA 水凝胶释放G4 PAMAM-IBU，从而更好地发挥抑制细胞增殖的作用。

使用CCK-8试剂盒定量检测G4 PAMAM-IBU/GelMA水凝胶在共培养24 h 与72 h 时抑制成纤维细胞增殖的能力，GelMA 组与GelMA+MMP 组抑制效果与对照组相比差异无统计学意义（均P>0.05）。当水凝胶载IBU 或G4 PAMAM-IBU 后，开始显现其抑制增殖的能力，且添加MMP 后，由于水凝胶内含药物释放加快，抑制效果增强。与IBU/GelMA 组相比，G4 PAMAM-IBU/GelMA 组抑制成纤维细胞增殖的能力更强（图4B）。

图4 MMP响应性G4 PAMAM-IBU/GelMA水凝胶对成纤维细胞增殖的抑制作用Fig 4 Inhibitory effect of MMP-responsive G4 PAMAM-IBU/GelMA hydrogel on cell proliferation

3 讨论

肌腱损伤后，为抑制肌腱周围粘连组织生成，使用IBU 来减轻过度的炎症反应是一项重要的治疗方法［14］。然而，IBU为脂溶性药物，在体液中扩散较慢，局部使用效果不佳。使用药物载体增加药物的溶解性可有效地避免此类问题。其中，树枝状大分子可将药物包裹在其内部的孔隙中，并与药物形成纳米粒子，从而显著提高药物的溶解性［15-16］。

本研究将IBU 包裹于树枝状大分子G4 PAMAM 内构成G4 PAMAM-IBU，使IBU 的溶解度显著提高；且IBU在12 h 内逐渐解离，与单纯的IBU 相比，有利于IBU 在局部缓慢释放，发挥长效作用。体外实验证明，G4 PAMAM 不仅可以提高IBU 的溶解度，还有利于IBU发挥其抑制成纤维细胞增殖的作用。当IBU 的浓度相同时，G4 PAMAM-IBU 的抑制增殖效果更强，这可能是由于G4 PAMAM 表面的氨基正电荷可与带负电的细胞膜加强接触，促进G4 PAMAM-IBU 复合物入胞并释放其包含的IBU 发挥药理作用［17］；此外，有研究［18］表明，该类树枝状大分子可以降低药物的细胞内清除率，延长药物的作用时间，进一步证实了G4 PAMAM 作为药物载体的优越性。

为实现IBU 在局部的按需释放，增加IBU 局部的缓释效果，我们将G4 PAMAM-IBU 包载于具有MMP 响应性的GelMA 水凝胶中。 在MMP 存在的条件下，G4 PAMAM-IBU可在72 h从水凝胶体系内释放超过70%；因此该制剂有望实现在肌腱损伤的早期炎症期（高MMP）释放IBU 来发挥作用。之后，我们对G4 PAMAM本身的细胞毒性作用进行研究，将安全浓度的G4 PAMAM 与IBU 结合，装载至GelMA 水凝胶中。体外实验证实，G4 PAMAM-IBU/GelMA 水凝胶可以有效地抑制成纤维细胞的增殖。同时，相同IBU 浓度的情况下，与IBU/GelMA组相比，G4 PAMAM-IBU/GelMA组抑制细胞增殖作用更强，印证了之前的实验结论。此外，培养基中添加MMP 后，由于GelMA 水凝胶发生降解，所载药物释放加快，从而增强了IBU抑制增殖的效果。

综上所述，本研究构建了一种载G4 PAMAM-IBU 的GelMA 水凝胶并观察了其体外抑制成纤维细胞增殖的效果，结果发现该水凝胶可在模拟体内炎症条件下释放IBU，发挥其抑制成纤维细胞增殖的作用，在防治肌腱粘连方面具有一定的应用前景。