蜕膜巨噬细胞调控滋养细胞侵袭力的研究

沙晓燕?伍彬升?鲍俊杰?刘慧姝

【摘要】目的 探討蜕膜巨噬细胞对滋养细胞侵袭力的调控。方法 取20 ～ 35岁女性正常早孕（6 ～ 7+6周）行人工流产的蜕膜组织15 ～ 20 g。将蜕膜组织充分清洗后使用Collagenase和Dnase消化2次，每次30 min，细胞悬液过滤后通过CD14+免疫磁珠分选，并行免疫荧光鉴定。流式细胞仪分析巨噬细胞M1型（CD80+和CD86+）和M2型（CD163+和CD206+）。获得的巨噬细胞置于6孔板培养，24 h后收集细胞上清。巨噬细胞上清与滋养细胞系HTR-8/SVneo共培养24 h，实时定量PCR检测HTR-8/SVneo的水通道蛋白1（AQP 1）mRNA相对表达量变化，以及基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和MMP-9 mRNA相对表达量的变化。应用实时无标记细胞分析技术（RTCA）检测人早孕蜕膜巨噬细胞上清对人滋养层细胞系HTR-8/SVneo侵袭力的影响。结果 成功建立人类早孕蜕膜巨噬细胞体外培养体系。流式细胞检测显示，人类正常早孕蜕膜组织中巨噬细胞以M2型为主，约占全部巨噬细胞的87%。巨噬细胞上清使HTR-8/SVneo的AQP 1和MMP-9 mRNA相对表达量升高（P均< 0.001）。RTCA结果显示巨噬细胞上清明显增强HTR-8/SVneo的侵袭力（P < 0.001）。结论 体外培养条件下，蜕膜巨噬细胞可能通过介导AQP1表达升高而增强滋养细胞的侵袭力。

【关键词】蜕膜巨噬细胞;水通道蛋白1;滋养细胞侵袭力;实时无标记细胞分析

Study of the regulation of trophoblast invasion by decidual macrophages Sha Xiaoyan， Wu Binsheng， Bao Junjie， Liu Huishu. Department of Obstetrics， Preterm Birth Prevention and Treatment Research Unit， Guang-zhou Women and Childrens Medical Center， Guangzhou Medical University， Guangzhou 510623， China

Corresponding author， Liu Huishu， E-mail： liuhuishu@ gwcmc. org

【Abstract】Objective To investigate the regulatory effect of decidual macrophages on the invasion of trophoblast. Methods Decidual tissues （15-20 g） were collected from clinically normal first trimester （6 - 7+6 weeks） pregnant women （20-35 years old） who underwent elective termination of pregnancy for non-medical reasons. Freshly-collected decidual tissues were rinsed with PBS and digested with collagenase Type IV and DNase I for 30 min twice. Macrophages were purified using a Ficoll-Hypaque gradient followed by CD14+ selection using magnetic beads， and identified by immunofluorescence. The percentage of M1 macrophages （CD80 and CD86） and M2 macrophages （CD163 and CD206） were analyzed by flow cytometry. The macrophages were cultured in a 6-well plate and the supernatant was collected 24 h later. The macrophage supernatant was co-cultured with trophoblast cell line HTR-8/SVneo for 24 h. The changes in the relative expression of AQP1 in HTR-8/SVneo as well as those of matrix metalloproteinase 2 （MMP2） and MMP9 were detected by real-time quantitative PCR. Real-Time Cell Analysis was used to evaluate the effect of macrophage supernatant on the invasiveness of HTR-8/SVneo. Results An in vitro cell culture system of human early pregnant decidual macrophages was established. Flow cytometry results showed that M2 macrophages were predominant in normal early pregnant decidual tissues， accounting for approximately 87%. Macrophage supernatant significantly up-regulated the expression levels of AQP 1 and MMP 9 in HTR-8/SVneo （both P < 0.001）. RTCA demonstrated that macrophage supernatant significantly enhanced the invasiveness of HTR-8/SVneo （P < 0.001）. Conclusion Decidual macrophages may enhance the trophoblast invasiveness by mediating the up-regulated expression of AQP 1 in vitro.

【Key words】Decidual macrophage;Aquaporin 1;Trophoblast invasion;Real-time cell analysis

胎盘滋养细胞侵袭力异常可引起流产、子痫前期/子痫、胎儿生长受限、妊娠滋养细胞疾病、胎盘植入等妊娠相关性疾病[1]。巨噬细胞在母胎界面免疫状态的形成和维持中发挥了重要的调控作用[2]。巨噬细胞如果发生分化异常、亚群平衡失调或功能异常时，也会导致流产、子痫前期、胎儿生长受限等病理妊娠及不良妊娠结局[3]。母胎界面巨噬细胞等免疫细胞可能调控滋养细胞的侵袭，但具体机制不清。多项研究显示，水通道蛋白1（AQP1）不仅调控多种细胞的水通透性，而且介导病理生理变化过程中的细胞迁移及侵袭[4]。本研究探讨蜕膜巨噬细胞对滋养细胞侵袭力的调控，旨在为滋养细胞侵袭力异常相关疾病的研究提供新的思路，现报告如下。

材料与方法

一、材 料

1. 蜕膜组织

2018年7至12月在本院计划生育门诊要求人工流产、孕6 ～ 7+6周的正常妊娠妇女（20 ～ 35岁）13例，取其人工流产术后的蜕膜组织。入组者既往月经规律，无自然流产等不良孕产史，无内科合并疾病，本次妊娠期间无阴道异常出血，B超检查提示胚胎发育正常。所有操作已通过广州市妇女儿童医疗中心伦理委员会审批，入组者均已签署知情同意书。

2. 主要设备

包括低温冰箱（Baxter，美国），恒温水浴箱（上海森信实验仪器有限公司，中國），微量加液器（Eppendoff，德国），生物显微镜（Olympas BX 50，日本），台式高速离心机（上海安亭科学仪器厂， 中国），CO2细胞培养箱（Eppendorf公司，德国）， 免疫磁珠细胞分选（MACS）分离器（Mihenyi Biotec， 德国）， MACS分离柱（Miltenyi Biotec， 德国），流式细胞仪（BD FACS Canto， 美国），iCelligence实时细胞功能分析仪DP（ACEA， 美国），荧光定量PCR仪Mx3000P（Agilent Stratagene， 美国）。

3. 主要材料

滋养细胞系HTR-8/SVneo由Gendie Lash 教授赠送，购于ATCC。其他材料包括胎牛血清（Gibco公司， 美国），DMEM/F12培养基（Gibco公司， 美国），0.25%胰酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液（Gibco公司，美国），RPMIl640（Sigma公司，德国），CD14一抗（Sigma公司，德国），CY3-兔抗鼠二抗（Sigma公司， 德国），MACS抗CDl4抗体磁珠（Miltenyi Biotec， 德国），CD14 PerCP、HLA-DR APC、CD80 FITC、CD86 PE-Cy7、CD163 BV421、CD206 PE流式抗体（BD公司， 美国），基质胶（Corning公司， 美国）。

二、实验方法

1. 蜕膜巨噬细胞原代培养及鉴定

收集蜕膜组织15 ～ 20 g，生理盐水充分清洗，去除残留血块。将蜕膜切成小块组织，转移至含有15 ml 消化液（含胶原酶1 g/L和DNA酶 0.04 kU/L）的50 ml离心管中。将离心管置于MACS 转子上，配平，转动30 min。取出离心管，静置2 ～ 3 min使组织沉淀。取40 μm细胞筛过滤组织上清液。重复消化2 ～ 3次。已过滤的组织上清液500×g离心5 min，弃上清。加入15 ml含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基，置于T75培养瓶中培养过夜，备用（13例组织中蜕膜细胞培养成功10例）。

次日将T75培养瓶中的贴壁细胞转移至离心管中，500×g离心5 min;用180 μl预冷的MidiMACS缓冲液重悬细胞沉淀，加入20 μl CD14磁珠，置于4℃冰箱孵育15 min。将MACS磁柱固定在分离器上，提前用1 ml MidiMACS缓冲液将柱子润湿。取800 μl预冷的MidiMACS缓冲液加入细胞中。细胞过柱，加入1 ml MidiMACS缓冲液清洗磁柱，重复3次，直至滤液澄清。收集磁柱上的细胞，500×g离心5 min，RPMI1640完全培养基重悬细胞沉淀，置于37℃、5%CO2的培养箱内培养。免疫荧光鉴定后将蜕膜巨噬细胞传代于6孔板中，每孔1×106个细胞，加入2 ml含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，置于细胞培养箱内培养24 h，收集细胞上清备用。

2. 流式细胞仪检测蜕膜巨噬细胞分型

次日取T75培养瓶中约1×106个贴壁细胞进行流式细胞仪检测，CD14和HLA-DR标记蜕膜巨噬细胞，CD80和CD86标记M1型蜕膜巨噬细胞，CD163和CD206标记M2型蜕膜巨噬细胞。

3. 滋养细胞系HTR-8/SVneo的表达变化检测

滋养细胞HTR-8/SVneo传代于6孔板，每孔3×106个细胞，DMEM/F12完全培养基培养。细胞贴壁后更换培养基并分组，对照组予1/2 DMEM/F12完全培养基+1/2 RPMI1640完全培养基，实验组予1/2 DMEM/F12完全培养基+1/2巨噬细胞上清。培养24 h后分别收集细胞，实时定量PCR检测AQP 1和基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、MMP-9表达的变化，引物序列见表1，2-△△Ct法计算目的基因mRNA相对表达量。

4. 滋养细胞侵袭力检测

应用xCELLigence DP多功能实时无标记细胞分析（RCTA）仪，使用CIM检测板检测滋养细胞侵袭力。CIM下室铺基质胶20 μl，放入细胞培养箱4 ～ 6 h，待基质胶完全凝固后方可用于实验。根据CIM下室分组，对照组予85 μl DMEM/F12完全培养基+80μl RPMI1640完全培养基;实验组予85 μl DMEM/F12完全培养基+80 μl巨噬细胞上清液。CIM上室与下室组合，上室加入30 μl无血清DMEM/F12培养基，置于37?C、5% CO2的培养箱平衡1 h，置于DP 系统上进行基线测量。上室加入100 μl无血清DMEM/F12 HTR-8/SVneo细胞悬液，每孔细胞数目为5×104个，均平行设置复孔。室温放置30 min后放入培养箱的仪器上，每15 min监测并记录细胞指数值（CI，CI越高代表穿过基质胶的细胞数量越多，即细胞的侵袭力越高），连续观察48 h。

三、统计学处理

采用 SPSS 23.0对数据进行统计学处理及分析。计量资料均符合正态分布，以表示，组间比较采用t检验。P < 0.05 为差异有统计学意义。

结果

一、蜕膜巨噬细胞原代培养及鉴定

应用MACS分离人类早孕蜕膜巨噬细胞，可得到活性较高的巨噬细胞。应用免疫荧光方法进行巨噬细胞CD14抗体的再次鉴定，确定所分离的细胞为蜕膜巨噬细胞，见图1。

二、蜕膜巨噬细胞的M1、M2分型

应用流式细胞仪进行巨噬细胞的分型鉴定，人类早孕蜕膜巨噬细胞中以M2型为主，约占全部巨噬细胞的87%，见图2。

三、滋养细胞系HTR-8/SVneo的AQP1、MMP-2、MMP-9 mRNA相对表达量变化

实验组蜕膜巨噬细胞上清液与滋养细胞共培养后，滋养细胞AQP1 mRNA及MMP-9 mRNA相对表达量均比对照组升高（P均< 0.001），MMP-2表达无明显变化（P > 0.05），见图3和表2。

四、蜕膜巨噬细胞对滋养细胞系HTR-8/SVneo侵袭力的影响

RCTA显示，实验组的CI值更高，即巨噬细胞上清液使人滋养层细胞系HTR-8/SVneo的侵袭力更强（见图4）。滋养细胞系HTR-8/SVneo实时监测48 h，实验组CI值为2.52±0.15，對照组为1.63±0.13，实验组CI值高于对照组（t = 13.652，P < 0.001）。

讨论

滋养细胞侵袭和迁移至子宫的分子机制目前尚不清楚，但多项研究显示其侵袭过程是分子和细胞的相互作用调节，受滋养细胞本身和母胎界面微环境的精细调控。生理妊娠情况下，巨噬细胞普遍存在于母胎界面，蜕膜巨噬细胞主要参与蜕膜化的进程，促进母胎免疫耐受环境形成、协助滋养细胞侵入和螺旋动脉形成等。但蜕膜巨噬细胞和滋养细胞的生物学行为调控机制尚不清楚。本研究通过体外培养人早孕蜕膜巨噬细胞，证实早孕蜕膜组织中主要为M2 型巨噬细胞;并将蜕膜巨噬细胞在体外条件下与滋养细胞共培养，结果显示巨噬细胞可增强滋养细胞的侵袭力，而滋养细胞的AQP1及MMP-9表达升高。

巨噬细胞按照其表型和分泌的细胞因子可以分为2种极化类型，即经典活化的M1 型和选择性活化的M2型巨噬细胞[5]。母胎界面中的巨噬细胞主要为M2型，分泌高水平的抑制性细胞因子IL-10，低表达促炎性细胞因子IL-1β，因而有利于维持免疫耐受及正常妊娠状态。妊娠期疾病或者母胎界面微环境的变化可使M1型和M2型巨噬细胞发生相互转化。Li等[3]的研究显示，子痫前期孕妇蜕膜中巨噬细胞数量偏高，且粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）表达过量;而GM-CSF 可诱导巨噬细胞向M1型极化[6]。因此，研究者认为M1 型巨噬细胞与子痫前期的发生密切相关。另一研究报道中，胎盘巨噬细胞CD74缺失后，活化的巨噬细胞向M1型转变，且高表达TNF-α、MCP-1等，而CD74基因敲除小鼠的子宫变小，螺旋动脉重塑受阻，并出现胚胎生长受限，研究者认为巨噬细胞向促炎方向的活化改变，干扰了滋养细胞的正常功能，导致病理妊娠[7]。

研究显示AQP1不仅调控多种细胞的水通透性，而且介导病理生理变化过程中的细胞迁移及侵袭[4， 8]。Mu等[9]研究显示，AQP1在大鼠胶原诱导的关节炎中表达升高，AQP1 siRNA通过抑制β-catenin信号传导通路抑制关节炎成纤维样滑膜细胞的增殖、迁移和侵袭。Shu等[10]对子宫内膜异位症小鼠进行研究，结果显示AQP1在子宫内膜异位症中呈高表达，通过siRNA抑制AQP1基因表达使子宫内膜细胞黏附和侵袭能力增强，细胞凋亡增加，且血管生成受到抑制。

本研究通过体外培养人早孕蜕膜巨噬细胞，证实早孕蜕膜巨噬细胞中主要为M2型巨噬细胞，蜕膜巨噬细胞在体外条件下与滋养细胞共培养，结果显示巨噬细胞可增强滋养细胞的侵袭力，而滋养细胞的AQP1及MMP-9表达升高。因此，蜕膜巨噬细胞在体外培养条件下可促进滋养细胞的侵袭，这可能与调控滋养细胞AQP1的表达有关。至于是否能通过调节蜕膜巨噬细胞的活性来调节滋养细胞AQP1 的表达，进而调控滋养细胞的侵袭，预防胎盘发育异常相关疾病，还需进一步探索。

参 考 文 献

[1] 杨建波， 陈汉青. 胎盘种植异常的产前诊断与预防. 新医学， 2009， 40（1）：9-11.

[2] Ning F， Liu H， Lash GE. The role of decidual macrophages during normal and pathological pregnancy. Am J Reprod Immunol， 2016， 75（3）：298-309.

[3] Li M， Piao L， Chen CP， Wu X， Yeh CC， Masch R， Chang CC， Huang SJ. Modulation of decidual macrophage polarization by macrophage colony-stimulating factor derived from first-trimester decidual cells： implication in preeclampsia. Am J Pathol， 2016，186（5）：1258-1266.

[4] Sha XY， Liu HS， Ma TH. Osmotic water permeability diversi-fication in primary trophoblast cultures from aquaporin 1-deficient pregnant mice. J Obstet Gynaecol Res， 2015， 41（9）：1399-1405.

[5] Brown MB， von Chamier M， Allam AB， Reyes L. M1/M2 macrophage polarity in normal and complicated pregnancy. Front Immunol， 2014， 5：606.

[6] Weiss G， Sundl M， Glasner A， Huppertz B， Moser G. The trophoblast plug during early pregnancy： a deeper insight. Histochem Cell Biol， 2016， 146（6）：749-756.

[7] Przybyl L， Haase N， Golic M， Rugor J， Solano ME， Arck PC， Gauster M， Huppertz B， Emontzpohl C， Stoppe C， Bernhagen J， Leng L， Bucala R， Schulz H， Heuser A， Weedon-Fekj?r MS， Johnsen GM， Peetz D， Luft FC， Staff AC， Müller DN， Dechend R， Herse F. CD74-downregulation of placental macrophage-trophoblastic interactions in preeclampsia. Circ Res， 2016， 119（1）：55-68.

[8] Tomita Y， Dorward H， Yool AJ， Smith E， Townsend AR， Price TJ， Hardingham JE. Role of aquaporin 1 signalling in cancer development and progression. Int J Mol Sci， 2017， 18（2）：299.

[9] Mu YR， Zhou MY， Cai L， Liu MM， Li R. Overexpression of aquaporin 1 in synovium aggravates rat collagen-induced arthritis through regulating β-catenin signaling： an in vivo and in vitro Study. J Inflamm Res， 2020， 13：701-712.

[10] Shu C， Shu Y， Gao Y， Chi H， Han J. Inhibitory effect of AQP1 silencing on adhesion and angiogenesis in ectopic endometrial cells of mice with endometriosis through activating the Wnt signaling pathway. Cell Cycle， 2019， 18（17）：2026-2039.

（收稿日期：2020-10-09）

（本文編辑：林燕薇）