高效酶提取鸡肺明胶及其结构与性质的研究

潘佳昕， 杨 恒， 时海波， 张新笑， 邹 烨， 徐为民， 王道营

（江苏省农业科学院 农产品加工所，江苏 南京 210014）

2017 年，中国的鸡肉产量为 1 200 万吨[1]，鸡肺产量约为8.5 万吨， 但其高值化产品的开发与综合利用却没有很好地进行。 鸡肺难以清洗，故不为人类食用。 目前，鸡肺基本以赠送的方式外包给养殖户作为狐狸和貂等的动物饲料或直接弃置于环境中，造成副产物资源浪费以及环境污染。 鸡肺干物质中蛋白质质量分数高达70%，但现有文献对鸡肺的研究极少。 李小勇[2]、王春焕等[3]对猪肺及牛肺中的胶原蛋白进行了提取和纯化，为从动物肺中提取蛋白质提供了可行性参考，但有关鸡肺胶原蛋白的理化性质研究并未见报道。 明胶是一种从猪、牛、鱼等动物性食品副产物中提取的天然高分子化合物，是胶原在酸、碱、酶或高温下的水解变性产物[4]，可广泛应用于食品工业中。

胶原明胶化的过程涉及胶原三螺旋结构的共价交联的维系和稳定及非共价键的破坏，三螺旋结构从而展开，非螺旋结晶区的破坏使得胶原亚基分子游离出来[5]。 制备明胶预处理的方法主要包括酸法、碱法、酶法、超高压法等，目前，广泛应用于生产的只有传统的酸碱法，而对于酶法制胶的理论研究较少。 伴随着常规酸碱法产率低、生产周期长及废液污染等问题，Singh 等[6]比较了酸和胃蛋白酶预处理的明胶得率和特性，发现酶法提取率高，且对胶原的三螺旋结构无明显影响。 超声波产生的空化效应、机械效应等多重效应不但能加快化学反应的进行，促进蛋白质溶出，还能打开胶原的纤维结构促进酶解[7]。 Kim[8]等发现超声辅助乙酸提取鲈鱼皮胶原的得率较高。Li[7]等发现超声辅助胃蛋白酶提取的胶原与单一酶法比较，得率较高且生产周期缩短。

作者采用超声辅助酶解法从鸡肺中提取明胶，研究超声辅助酶提明胶的效果及在食品体系中的应用，为肉鸡副产物的高值化利用与综合开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鸡肺：常州市立华牧业有限公司提供；胃蛋白酶（USP 级）：上海源叶生物科技有限公司提供。

超声波细胞粉碎机（SCIENTZ-IID）：宁波新芝生物科技股份有限公司产品；磁力加热搅拌器（78-1）：常州国华电器有限公司产品；循环水式多用真空泵（SHB-Ⅲ）：南京科尔仪器设备有限公司产品；CHRIST 冷冻干燥机（Alpha 1-2 LDplu）：北京五洲东方科技发展有限公司产品； 差示扫描量热仪（STA-449C）：德国 NETZSCH 公司产品；圆二色谱仪（Jasco-715）：日本Jasco 公司产品；扫描电子显微镜 （EVO-LS10）： 德国 ZEISSE Oberkochen 公司产品；紫外分光光度仪（UV-6100）：上海美普达仪器有限公司产品； 马尔文激光粒度分析 （Zetasizer Nano Zs90）：英国Malvern 仪器有限公司产品；分散均质机T25：德国IKA 公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 鸡肺除杂鸡肺杂蛋白质去除参照李越[9]的方法，并加以修改。

1.2.2 常规热水提取鸡肺明胶参考张思琦[10]的方法提取明胶，并作改进。

1.2.3 超声辅助酶解提取鸡肺明胶取10 g 脱杂鸡肺， 溶于 0.5 mol/L 乙酸，200 W 超声处理 10 min，超声处理器工作 2 s，停歇 3 s。 随后于 42 ℃恒温水浴锅中150 r/min 磁力搅拌，加胃蛋白酶1 mL，酶提 4 h， 反应结束后 100 ℃灭酶 10 min。 放置室温，再将样品通过真空抽滤瓶抽滤，收集滤液，倒入干净的表面皿， 于-40 ℃冰箱冷冻， 最后冷冻干燥24 h，收集样品。

1.2.4 明胶得率的计算明胶的得率根据Nagarajan[11]等报道的方法测定，以去杂原料与制得样品经冷冻干燥后的质量的比值计。

1.2.5 热稳定性明胶的玻璃转化温度用差示扫描量热（DSC）仪测定，参考汲聪玲[12]的方法。 精准称量8 mg 样品蛋白于铝坩埚中，加盖密封，设置温度的扫描范围为 20～200 ℃，升温速率为 2 ℃/min。 以空铝坩埚为参比。

1.2.6 圆二色谱 （CD）明胶溶液的近紫外圆二光谱变化通过圆二色谱仪测定。 将制备的样品配制成质量浓度为0.1 mg/mL 蛋白溶液， 注入1 mm 厚的样品池。 设置扫描范围为190～260 nm，扫描速度为50 nm/min，光谱间隔为1.0 nm。CD 数据以平均椭圆率表示，采用CD Pro 软件分析明胶的二级结构。

1.2.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析配制分离胶（12 g/dL）和浓缩胶（5 g/dL），明胶的亚基组分测定参照汲聪玲[12]的方法并作改进。 将明胶溶液与pH 8.8 的0.06 mol/L Tris-HCl 缓冲液、质量分数 25%甘油、2% SDS、0.1%溴酚蓝、5% β-巯基乙醇混合，沸水煮 10 min 后 10 000 g 离心 3 min，取 10 μL上清液上样。用相对分子质量为11 000～135 000 的蛋白Markers 做对照。 加入电泳缓冲液 （质量分数0.1% SDS、0.192 mol/L 甘 氨 酸 、0.025 mol/L Tris-HCl），在 16 mA 电流下进行 30 min 电泳后，调节电流强度为32 mA 继续进行1.5 h。 电泳结束后，取用R-250 考马斯亮蓝对其染色30 min，然后用混合液（体积分数20%乙醇与80%蒸馏水） 脱色至能辨清条带为止。

1.2.8 紫外吸收光谱扫描鸡肺明胶的紫外吸收光谱采用紫外分光光度仪测定。 取适量明胶水解液，在190～500 nm 波长范围内，设置分辨率为0.5 nm，用紫外分光光度仪对明胶溶液进行扫描。 以去离子水为参比。

1.2.9 粒径分布采用马尔文激光粒度分析仪检测明胶颗粒的分布。 设置高稳定氦-氖激光器的光源为633 nm，固体蓝光光源波长为466 nm，扫描速度为 1 000 次/秒， 重复性误差≤±0.5%， 准确性误差≤±1.0%。 取 0.5 mol/L 乙酸的多分散系数（Polydispersity Index） 为 1.320， 明胶的散射指数（refractive index of the scatterers）为 1.500。 以湿法进样，每个样品测3 次，取平均值。

1.2.10 扫描电镜（SEM）取冻干后的明胶切片，置于EVO-LS10 型扫描电子显微镜的样品舱中，在15 mA 的电流下喷金90 s。 取出置于扫描电镜观察室，以200 倍的放大倍数，选取不同位置的数点，调节图像至清晰，观察并拍摄鸡肺明胶的微观结构。

1.2.11 乳化性利用浊度法测定明胶的乳化活性（EAI）和乳化稳定性（ESI）。 用磷酸钠盐缓冲溶液（PBS，0.1 mol/L）配制 10 g/L 明胶溶液 12 mL，并调节pH 至3.0，加入花生油5 mL。 采用均质机将混合液于10 000 g 下均质1 min，制得乳状液，分别在0 min 和 10 min 时从容器底部取 50 μL，加入 5 mL质量分数0.1%的SDS， 混匀后以质量分数0.1%的SDS 溶液作参比， 立即测定其在500 nm 处的吸光度 A0，10 min 后，测吸光度值 A10。

1.3 数据统计与分析

采用SPSS19.0 统计软件进行数据处理，样品作3 次平行试验。 用组间 ANOVA 进行统计分析，Turkey 检验用于组间数据分析，P＜0.05，表示两组之间差异显著，并用Origin 8.0 软件作图。

2 结果与分析

2.1 明胶得率和效率

明胶的得率为干燥后明胶干质量（g）与脱杂鸡肺干质量（g）的比例。 本试验中，胃蛋白提取的鸡肺明胶得率为30.08%，比常规热水提取的鸡肺明胶得率（8.77%）提高了2.43 倍。通常，鱼皮明胶的得率为50%左右[13]，鸡肺中的杂蛋白较多，并且鸡肺的韧性及分子内与分子间的交联程度较高， 导致鸡肺明胶的提取率较低， 仅高于经常规热水提取法制得的军曹鱼 （13.8%）[14]、 舌鳎 （10.3%）[14]、 罗非鱼鱼鳞（7.08%）[15]等少数鱼源明胶。

2.2 热稳定性

明胶的热变性温度通过差示量热扫描（DSC）法进行测定。加热过程的DSC 曲线中的吸热峰所对应的转变斜线中点即为明胶的热变性温度，它表示明胶分子的结构由螺旋向卷曲转变[16]。图1 显示，明胶胃蛋白酶提取的热变性温度为90.22 ℃， 略低于常规热水提取，这一结果与陈日春[17]的研究相符，通常酸法提取的胶原蛋白变性温度稍高于酶法提取的胶原蛋白。 明胶分子的交联作用越多，其变性温度越高[18]，表明胃蛋白酶提取的明胶分子间的交联程度较高。 试验提取的鸡肺明胶的热变性温度高于一般的鱼类明胶，如黄华双[19]提取的鱼鳞明胶（27 ℃）以及刘全娇[20]提取的罗非鱼皮明胶（76.36 ℃）。因此鸡肺明胶具有热变性温度高的优势，可通过复合改性制备可食性膜用于食品的天然包装中，因为其既不会因为温度的升高在保存期内熔化，又方便产品的运输。 此外也可作为稳定剂和增稠剂添加至对温度敏感的冷品，如冰淇淋、酸奶等食品中，能更好地抑制结晶[21]，降低熔化速度，使产品组织更坚实细腻。

图1 鸡肺明胶的DSC 曲线Fig.1 DSC curves of chicken lung gelatin films

2.3 圆二色谱（CD）

通常， 胶原在CD 光谱图中会表现出典型的三股螺旋结构的分子特征， 即在220～230 nm 和200 nm 处分别出现正吸收峰和负吸收峰[22]。 由图2 可见， 超声辅助酶提明胶在201 nm 波长处存在负吸收峰，在223 nm 波长出现了一定程度的正吸收峰。220～230 nm 波段的正值吸收对应蛋白质α-螺旋[23]，胃蛋白酶切断胶原分子的N 及C 端的非胶原性肽[24]，对胶原的三螺旋结构无明显影响，但会导致α链的降解[25]，导致正吸收峰不明显。 有研究表明，负峰强度越大，无规则卷曲程度越大[26]，图2 中胃蛋白酶提取的明胶的负峰强度明显小于常规热水提取的明胶，胶原的三螺旋结构较为完好，与郑雅爻等[27]的测试结果相符。 利用胃蛋白酶提取的明胶形成类胶原三股螺旋结构[28]， 天然胶原的α-螺旋部分解链，但仍维持着胶原的三螺旋结构，说明超声辅助酶提明胶的二级结构更加有序。

图2 鸡肺明胶的CD 图Fig.2 The CD spectra of gelatin extracted from chicken lung films

2.4 SDS-PAGE 分析

采用SDS-PAGE 检测明胶样品的亚基组成与相对分子质量分布，明胶分子包含 α1、α2、β 这 3 条链，相对分子质量在 130 000～250 000 之间[9]。 鸡肺胶原转变为明胶的过程涉及次级键的断裂，随机断裂的键造成了胶原水解产物组分的多样化，明胶分子既可能是单链，也可能是α 链片段的共价交联体[29]。 如图3，电泳条带2 显示，常规热水提取的鸡肺明胶组分包括α1、α2 链，以及不清晰的小分子片段，与李越[9]在SDS-PAGE 图谱中观察到的市售明胶类似。 鸡肺胃蛋白酶提取的明胶电泳条带1 没有明显的 α1、α2、β 这 3 条链对应的电泳条带中出现45 000～95 000 之间的一些占绝大部分的蛋白降解条带，没有明显的 α1、α2、β 这 3 条链对应的电泳条带。 在酸性条件下用胃蛋白酶处理可切断胶原分子N 及 C 端的非胶原性肽[24]，导致 α1、α2 链的展开。超声波可以对鸡肺胶原的三螺旋结构造成轻微降解，氢键的断裂使得肽链变得松散，利于后期酸性pH 条件下的酶处理。 随着酶解时间的延长，加热过程中胶原的肽端受到破坏， 分子间的共价键断裂，高分子组分更容易降解，明胶分子游离出来。 孙艺等[30]在提取大目金枪鱼皮明胶中的发现，内源性蛋白酶的存在使明胶降解为小分子，电泳条带1 中出现了低于45 000 的几条模糊的小分子蛋白条带，可能是由于进一步的酶解， 明胶断裂为更小的分子。也可能是在酸性条件下浸提使明胶发生了热降解[26]，溶胀的胶原由于其疏松的结构在热水提取时更容易降解。

图3 鸡肺明胶的SDS-PAGE 图Fig.3 SDS-PAGE electrophoresis pattern of gelatin from chicken lung

2.5 紫外吸收光谱图

明胶中由于存在 C＝O、CONH2、—COOH 等发色基团， 紫外特征吸收峰通常出现在220 nm 波长左右[31]，结果见图4。 与图中曲线吸收峰（229 nm）吻合，证明明胶肽链分子中存在酰胺键[32]，鸡肺明胶溶液的紫外吸收光谱与Chandra[32]等的结果类似。大多数蛋白质中存在的一些芳香族氨基酸残基在波长270～280 nm 处存在紫外吸收峰，在一般经纯化的明胶中不会出现，超声辅助酶提明胶与常规热水提取的明胶在280 nm 处有微量吸收， 说明明胶样品中只含有少量芳香族氨基酸，可以初步判断试验提取的鸡肺明胶具有较高的纯度。 超声辅助酶提明胶的杂峰较常规热水提取的明胶杂峰更明显。

2.6 粒径分布

由图5 可知，超声辅助胃蛋白酶提取的明胶平均粒径为396 nm，小于常规热水提取。 超声波处理会改变明胶的二级结构，Yu 等[33]的研究表明超声波处理过的明胶，其平均粒径显著下降。 可能是由于超声波的物理效应对分子间静电作用的破坏以及气穴效应产生的强剪切力[34]，使得后续酶解过程中胶原的三螺旋结构解链程度较高，分子间的交联键断裂更为彻底，大分子蛋白进一步降解得到明胶亚基，与SDS-PAGE 分析所得结果一致。

图4 鸡肺明胶的紫外图谱Fig.4 Ultraviolet absorption spectra of gelatin from chicken lung

图5 鸡肺明胶的粒径分布Fig.5 Particle size distribution of gelatin from chicken lung

2.7 扫描电镜（SEM）

鸡肺明胶的微观结构利用SEM 观察，与常规热水提取的鸡肺明胶（图6（b））相比，经过超声辅助酶提取的明胶化胶原（图6（a）），表面有较大程度的破碎，甚至出现较多的孔洞，这一变化与陈书霖等[35]研究的不同酸预处理下鲢鱼皮明胶的表观类似。 在酸性条件下胶原分子间的排斥力会增强，结果导致胶原在乙酸浸泡过程中逐渐发生溶胀，胶原表观被明显破坏。 超声波对明胶的分子结构起到疏松的效果[36]，鸡肺胶原蛋白间原本紧密的交联变得松散，有利于后期在酸性条件下进行的酶解，使分子间的共价交联和非共价键断裂，大分子的胶原蛋白绝大多数被降解为小分子的胶原亚基，可能导致分子间疏水基团的暴露，明胶化胶原呈无规则卷曲状。 超声辅助酶提明胶具有疏松孔洞的结构特点，在糖果工业中，可作为搅打剂应用于软糖的生产，起吸水、增大体积、维持形态的作用。

图6 鸡肺明胶的微观结构（×200）Fig.6 Microstructure of gelatin from chicken lung（×200）

2.8 乳化性

明胶作为一种亲水、亲油的表面活性剂，肽链的疏水基团使其具有一定的乳化性[37]，可以阻止晶体或离子的聚集，稳定非均相悬浮液。 高速匀浆机的分散作用使得明胶分子与油滴界面接触的数量增多，溶液中的明胶蛋白覆在油滴表面形成水包油的状态。 制备的两种明胶的乳化活性无明显差异，其中超声辅助酶提明胶的乳化稳定性 （（139.92±9.8） min）略低于常规热水提取明胶（（148.72±11.3）min），但仍显著高于鲶鱼皮明胶[38]（＜60 min）。 乳液中分子间的吸引力与运动碰撞形成了较大的液滴，其表面的解吸附作用使得液滴变得不稳定，均质后的明胶会出现一些较大的乳液液滴。 明胶分子与油滴界面间的疏水平衡随着明胶溶解度的降低而被破坏，超声辅助酶提明胶的乳化稳定性由于乳液粒径的增大而出现下降，可通过添加表面活性剂或修饰侧链基团对酶提明胶进行改性。

3 结 语

以鸡肺为原料提取明胶，通过分析其结构和乳化性，探究超声辅助酶法的影响。 研究发现，在超声波和胃蛋白酶的作用下，鸡肺明胶的相对分子质量降低， 表面微观结构疏松破碎， 平均粒径减小13.7%。 试验结果表明，鸡肺明胶具有较高的纯度，与常规热水法相比，超声辅助酶提明胶的生产周期显著缩短，得率显著提高，具有良好的热稳定性与乳化稳定性，二级结构更为有序，可作为鱼源明胶的替代品。