核桃JrJAZ 基因家族鉴定与转录表达分析

刘 凯，李津津，王红霞，李林晴，赵书岗，张俊佩，马庆国，张志华

（1.河北农业大学 山区研究所/河北省山区农业技术创新中心/国家北方山区农业工程技术研究中心， 河北 保定 071001；2.河北农业大学 园艺学院，河北 保定 071001；3.河北农业大学 生命科学学院， 河北 保定 071001；4.中国林业科学研究院林业研究所/国家林业和草原局林木培育重点实验室， 北京 100091）

核桃(Juglans regia L.)是喜温树种，适宜生长的温度范围是年均温9 ～16 ℃，由于核桃自身枝条髓心大、水分多、抗寒性差，强大寒流、倒春寒、晚霜对核桃的生长发育是一个限制因子，会使核桃组织器官受冻，影响产量，甚至绝收［1-2］。茉莉酸（Jasmonic acid，JA）是植物自身参与生物或者非生物胁迫的一种重要的植物激素，可显著刺激抗逆酶活性提高，促进萜类、黄酮、生物碱的合成及相关途径基因表达［3］。JAZ (jasmonate ZIM-domain) 蛋白是JA 信号转导过程中重要的负调控蛋白，该家族蛋白具有TIFY 和Jas 2 个保守的功能结构域，属于TIFY 转录因子超家族成员之一［4］。目前研究中，JAZ 主要由JA 活体存在与否来决定参与方式：当不存在JA 时，与MYC 互作起到抑制JA 的转录激活［5］。曹宏哲等研究报道，在玉米中ZmMYC7 与AtJAZ1、AtJAZ2、AtJAZ3 等能在酵母细胞中直接互作，参与植物的生物防御反应［6］。Tangzhi Du 等研究指出丹参SmMYC2 与SmJAZ3/8 相互作用抑制了丹酚酸生物合成的途径［7］。另外一种是存在JA时，JAZ 与冠菌素不敏感1（COI1）结合泛素化被降解，从而激活多种JA 反应［6］。目前JAZ 在JA信号转导途径中的重要地位已经被证明［7］。1971 年，Aldridge 等人［8］首次在二孢属真菌(Lasiodiplodia thebrornae)的培养物滤液中分离到游离态的茉莉酸，而且拟南芥［9］、玉米［10］、粗山羊草［11］、甘蔗［12］中鉴定了JAZ 基因家族。研究表明茉莉酸正调控植物对拟南芥低温胁迫的反应，外源施用茉莉酸可显著提高植物耐寒性［13］，有研究也证实了这一观点［14］。但是目前为止，关于核桃的研究主要集中在栽培、物理防寒等方面，而核桃JAZ 家族成员的系统进化关系及其在核桃非生物胁迫过程中的表达分析等尚未见系统报道。本研究利用转录组测序及生物信息学方法，对核桃JAZ 家族基因进行理化性质分析、保守结构域分析、系统进化分析及核桃在低温胁迫下的转录分析，为阐明核桃JAZ 家族基因的功能及其调控机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料核桃(Juglans regia L.)种植于河北农业大学标本园，盆栽，同一砧木嫁接‘辽8’（耐低温）和‘清香’（不耐低温），2 年生苗。用于后续研究的试验材料分为正常组(冷处理0 h)和0.5 ℃冷处理48 h。采集第1 片复叶中自单叶起左数第2 叶片送至北京诺禾致源科技股份有限公司用于RNASeq 测序，3 株混合后为1 次，共3 次重复。

1.2 试验方法

1.2.1 核桃JAZ 基因家族分析 根据TAIR（https://www.arabidopsis.org/）拟南芥JAZ 家族蛋白序列信息应用HMMER 3.1b 软件构建隐马尔科夫模型，并于NCBI 搜索下载核桃蛋白序列（www.ncbi.nlm.nih. gov/genome/?term=txid51240［orgn］，GCF_001411555.1），并结合转录组分析对家族成员进行鉴定。利用NCBI 在线分析软件（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/）分析蛋白保守结构域，利用在线分析工具Gene Structure Display Server 和MEME 对（http://meme-suite.org/）核桃JAZ 家族基因进行基因结构和保守基序分析。玉米JAZ 家族基因序列信息来自Maize（https://www.maizegdb.org/），水稻JAZ 家族基因序列信息来自 RGAp（http://rice.plantbiology.msu.edu/）。利 用MEGA7.0 软 件中的生物进化距离法（Neighbour-Joining, NJ）构建JrJAZ、AtJAZ、ZmJAZ 和OsJAZ 家族系统发生树，Bootstrap 值为1 000。

1.2.2 核桃JAZ 基因的生物信息学分析 利用NCBI 在线分析软件ORF Finder (https://www.ncbi. nlm.nih.gov /orffnder/) 查找JAZ 基因家族成员的ORF。蛋白质的理化性质使用ExPASy (https://web.expasy.org/ protparam/) 在线网站分析；利用NetPhos 3.1 Server 和Net NGlyc 1.0 Server 分 别 预测蛋白的糖基化和磷酸化位点；利用SignalP3.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP） 在线工具对信号肽预测；TMHMM 法分析蛋白质的跨膜区：基于HMM 方法（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）的蛋白质跨膜区预测工具；利用ngLOC 与Nuc-PLoc 在线软件预测亚细胞定位；利用STRING 在线分析蛋白互作；利用Plantcare 在线工具分析基因家族成员启动子序列功能。

2 结果与分析

2.1 核桃基因组JAZ 家族成员鉴定及分析

2.1.1 核桃基因组JAZ 家族成员基本信息 利用拟南芥JAZ 家族蛋白序列信息构建隐马尔科夫模型，以此来搜索核桃蛋白数据，结合转录组测序，初步筛选出47 个核桃JAZ 家族基因。利用Pfam 结构域分析，去除冗余后最终获得17 个核桃JAZ 家族基因（见表1），编码17 条蛋白质序列，根据Location 位置并对其命名。这些JAZs 基因的长度最短的为812 bp（JrJAZ17），最长的为5 601 bp（JrJAZ6），开放阅读框长度在417 bp（JrJAZ1、JrJAZ2）～1 149 bp（JrJAZ12），外显子有2 ～9 个，内含子1 ～8 个，翻译得到的JAZs 蛋白质的长度均处于138（JrJAZ13、JrJAZ16）～ 385（JrJAZ8）个氨基酸之间；等电点在8.47 ～10 之间，核桃JAZ 家族成员均为碱性蛋白。

表1 核桃JAZ 家族成员的基因信息Table 1 Basic information of JAZ family genes from walnut

图1 核桃JAZ 家族成员保守序列比对分析Fig.1 Multiple alignment of JAZ family genes from walnut

2.1.2 核桃基因组JAZ 家族成员保守结构域分析 利用NCBI 在线分析软件比对核桃JAZ 家族成员的蛋白序列并分析其保守结构域(图1)，发现核桃17 个家族成员含有典型的TIFY 和jas 2 个高度保守的结构域，符合JAZ 家族类型特点。2.1.3 核桃基因组JAZ 家族成员理化性质分析 利用ExPasy 将基因的蛋白大小（kD）、稳定系数、疏水性等蛋白理化性质进行预测（见表2），JrJAZ1 ～JrJAZ17 蛋白的不稳定系数介于 38.5 ～91.86 之间，除JrJAZ8 其余蛋白均为不稳定蛋白；且 17 个 JrJAZs 蛋白的平均疏水性均为负值，表明核桃JrJAZ 蛋白均属于亲水性蛋白；利用 SignalP 3.0 Server 在线工具和TMHMM 法分析蛋白质的信号肽预测和跨膜结构，结果显示核桃JrJAZ 家族各成员无跨膜结构和信号肽，由此推断，JrJAZ1 ～ JrJAZ17 蛋白为胞内无跨膜结构的非分泌蛋白；利用ngLOC 和Nuc-PLoc 在线软件预测结果显示，除JrJAZ17 蛋白定位于细胞核和叶绿体，其余 16 个 JrJAZs 蛋白均定位于细胞核。

利 用Net NGlyc 1.01.0 和NetPhos 3.1Server 预测蛋白的磷酸化位点和糖基化，有助于了解核桃JAZ 家族成员在蛋白转录翻译后修饰的差异。磷酸化位点结果显示，17 个JAZ 蛋白均含有多个磷酸化位点(表 2)，主要体现在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化位点数量的差异。通过对核桃JrJAZ 家族成员 N-糖基化和 O-糖化的潜在位点分析结果显示，该家族成员含有数量不等的潜在位点。

表2 核桃JAZ 家族蛋白的理化性质Table 2 Basic information of JAZ family genes from walnut

2.2 不同物种 JAZ 家族进化树分析

本研究对核桃（17 个）、拟南芥（12 个）、玉米（27 个）及水稻（15 个）JAZ 家族蛋白进行了系统发育分析（图 2）。结果发现，核桃与玉米、拟南芥 JAZ 家族基因有一定的同源性，与双子叶拟南芥同源性较高，与单子叶植物水稻同源性较低。根据拟南芥分类将核桃17 个成员分为4 个亚族，亚族A 成员最少，只有2 个。

图2 JAZ 家族基因的系统发育树分析Fig.2 Phylogenetic tree of JAZ family

2.3 核桃基因组JAZ 家族基因结构与蛋白域保守结构域

为进一步研究核桃JAZ 基因结构进化，首先对其外显子内含子结构进行分析（见图3）。结果表明，核桃基因组JAZ 家族成员都包含由2 ～9 个内含子不等。同一个亚组中基因具有相似的内含子和外显子的结构。随后，利用 MEME 软件对这些蛋白序列和结构的保守性进行了分析（见图4）。根据其保守基序分布，将17 个核桃JAZ 家族分为6 类。在核桃JAZs 家族的17 个成员间发现共同的保守基序motif 1 和motif 2，即TIFY 和jas 2 个保守结构域。而且不同亚家族内的保守基序分布具有极高的相似度；但S 4 和S 6 亚家族中分别含有自己特有的保守基序，即motif 4/6 和motif 7。

图3 核桃JAZ 家族基因结构Fig.3 Gene structure analysis of JAZ family from Juglans regia

图4 核桃JAZ 家族蛋白保守基序分析 Fig.4 Conserved motif analysis of JAZ family from Juglans regia

2.4 核桃JAZ 家族基因启动子元件分析

核桃JAZ 基因启动子区与抗逆和激素相关元件的分布结果如图5 所示，除JrJAZ13 和JrJAZ16 无N 端外，核桃JAZ 基因启动子区存在丰富的激素信号和胁迫应答调控元件，可能是参与核桃抗逆相关。

图5 核桃JrJAZ 启动子区与抗逆和激素相关元件分布Fig.5 Distribution of stress-related and hormone-related parts in the promoter region of JrJAZ genes

2.5 核桃JAZ 家族蛋白互作预测

利用STRING 分析该蛋白序列的互作蛋白（见表3），以拟南芥蛋白数据库为参照，发现该家族成员分别与AtJAZ1、AtJAZ3、AtJAZ10、AtJAZ12、AtJAZ8、AtTify4a、AtPPD2 同源关系较近，分析结果表明家族成员蛋白与其他蛋白以及家族成员蛋白之间均可以发生互作。通过对核桃 JAZ 家族蛋白互作预测有助于更加进一步了解JAZ 家族成员在核桃体内发挥的功能。

表3 核桃JAZ 家族蛋白互作信息Table 3 Protein interaction information of JrJAZs

续表：

2.6 核桃JAZ 家族成员转录表达分析

将同一砧木嫁接‘辽宁8 号’（耐低温）和‘清香’（不耐低温），进行CK 组( 冷处理0 h) 和0.5 ℃冷处理48 h，建立了12 个cDNA 文库，并用IlluminaHise qx10 进行了测序，共获得6.17 亿条以上reads。发现低温胁迫48 h，以FPKM 为基因表达量衡量标准，核桃JAZ 家族基因成员均出现了不同程度的变化（图6）。用padj ＜0.05 and log2(golden change ＞0)检测12 个样品的JAZ 家族基因表达差异，发现在‘辽宁8 号’中JrJAZ1、JrJAZ3、JrJAZ4、JrJAZ5、JrJAZ7、JrJAZ9、JrJAZ17 为差异表达基因，而在‘清香’中JrJAZ1、JrJAZ3、JrJAZ4、JrJAZ5、JrJAZ7、JrJAZ9、JrJAZ15、JrJAZ16，在2 个品种中只有JrJAZ11 同时出现了显著下降的表达，进一步证明了启动子元件和蛋白互作的准确性。

图6 JAZ 家族基因的转录表达分析Fig.6 Transcriptional expression analysis of JAZ family genes

3 讨论

茉莉酸途径起抑制作用的因子JAZ，在植物生长发育和响应各种胁迫等诸多方面起重要的作用［15］。随着全基因组的测序，很多植物的JAZ 基因家族得到了鉴定和分析，在拟南芥中12 个［10］，巴西橡胶树7 个［16］，粗山羊草29 个［11］，山茶13 个［17］，本研究基于核桃基因组，运用生物信息学手段，筛选并分析核桃JAZ 家族17 个基因理化性质、基因结构、保守基序、进化关系及低温胁迫转录表达等特征，丰富了植物的JAZ 家族种类，也为进一步研究核桃JAZ 基因提供了理论依据。

本研究首先对鉴定的17 个JAZ 家族成员的保守结构域进行预测，均含有保守的TIFY 和Jas 保守结构域，属于TIFY 超家族中的亚家族，与玉米和粗山羊草中JAZ 蛋白结构研究一致［10-11］。对核桃17 个JAZ 家族成员的理化性质进行了分析，发现均为胞内无跨膜结构的非分泌蛋白，且17 个JrJAZs蛋白的平均疏水性均为负值，均属于不稳定亲水性蛋白，与甘蔗中JAZ 蛋白性质研究一致［12］；而且除JrJAZ17 蛋白定位于细胞核和叶绿体，其余16 个JrJAZs 蛋白均定位于细胞核，研究表明，植物JAZs蛋白可能定位于细胞核或叶绿体，与甘蔗蛋白定位中研究一致［13］。

磷酸化和糖基化是蛋白转录翻译后2 种重要的修饰方式，蛋白磷酸化修饰是植物细胞信号调控的普遍机制，糖基化则会影响蛋白的表达水平、结构及功能［18-19］。本研究中核桃17 个JAZ 家族成员蛋白磷酸化和糖基化的位点和数目各异，而且程度也不同，具体功能有待进一步研究。其次对鉴定的17个JAZ 家族成员的基因结构、保守基序进行预测。核桃JAZ 家族成员都包含有2 ～9 个内含子不等，且同一个亚组中基因具有相似的内含子和外显子的结构；在核桃JAZs 家族的17 个成员间发现共同的保守基序motif 1 和motif 2，即TIFY 和jas 2 个保守结构，研究结果与粗山羊草JAZ 蛋白保守基序中研究一致［11］。而且本研究对核桃、拟南芥、玉米及水稻JAZ 家族基因进行了系统发育分析，研究结果与双子叶植物拟南芥同源性较高，与单子叶水稻同源性较低，由进化关系可以看出，植物JAZ 基因家族在不同植物纲产生了特异性分化，产生特异性蛋白亚家族，造成了功能的多样性。

本研究针对核桃JAZ 家族基因启动子元件和蛋白互作进行了分析。启动子分析表明，15 个核桃JAZ 家族成员可能对不同的胁迫做出应答；以拟南芥蛋白数据库为参照，发现17 个核桃JAZ 族成员与多种蛋白互作，有多项研究表明互作蛋白参与植物胁迫响应过程。已有研究证实COI1 是茉莉素的信号传导必不可少的控制因子，COI1 突变会影响茉莉酸行传导［16］。MYC 具有较高的同源性，MYC2、MYC3 和MYC4 属于bHLH 家族，通过调节参与JA 生物合成和分解代谢的基因的转录来响应外界胁迫，并有研究证明拟南芥 ICE1（MYC2 的同源基因）调控低温胁迫相关基因的表达［20-21］。在内源或外源JAs 的作用下，植物体内的SOD、POD、PPO、CAT 等与抗逆相关保护酶系活性升高［22］。本研究发现核桃17 个JAZ 家族成员多数与拟南芥JAZ1、JAZ3、JAZ8、JAZ10、JAZ12 等 蛋 白 同源，说明核桃多数蛋白也可能具有相似功能。通过转录表达分析，JrJAZ1、JrJAZ3、JrJAZ4、JrJAZ5、JrJAZ7、JrJAZ9 等为差异基因，而且启动子区域与蛋白互作也证实相应蛋白包含与逆境和激素相关的元件，进一步证实了转录组表达分析的准确性。这些研究为进一步揭示核桃JAZ 基因相关功能提供了理论支撑，但具体调控机制有待进一步研究。