β-地中海贫血基因治疗的研究进展

邓玲 贺静

β-地贫是遗传性血液病，由β-珠蛋白基因（hemoglobin subunit beta，HBB），发生突变引起，是全球最常见的单基因疾病。HBB基因编码成人血红蛋白（adult hemoglobin，HbA）的β 亚基，HBB基因突变可消除或减少β-珠蛋白的合成，从而导致无效的红细胞生成，进而导致慢性溶血和严重贫血［1］。β-地贫根据病情轻重，可以分为三类：轻度、中度和重度。通常情况下，轻度地贫无需特殊治疗。中度和重度地贫主要采取以下方式：除铁治疗、输血治疗、骨髓造血干细胞异体移植、脾切除手术等［2］。其中，异体造血干细胞移植是根治地贫的方法，但费用巨大，且配型极其困难；其他方法只能够维持地贫患者生命，同样给家庭带来极大经济负担，且需消耗大量血液资源，患者生活质量极低，不能从源头上根治该疾病。近年来，基因编辑技术已被应用于基因治疗β-地贫的多项相关研究中，它通过插入、缺失或替换的手段对基因组进行靶向编辑，能让正常基因替换突变基因，代替有缺陷的β-珠蛋白；或重新开启γ-珠蛋白基因（hemoglobin subunit gamma，HBG）的表达，使γ-珠蛋白增加，这样就可以结合患者红细胞中过多的α-珠蛋白链，缓解β-地贫患者的贫血程度。因此基因编辑技术很有可能成为缓解甚至治愈β-地贫的治疗方法。目前，针对β-地贫的基因治疗策略主要分为两种，慢病毒介导的基因转移和基于基因编辑技术的策略。这两种策略都是通过递送具有正常生物学功能的HBB基因或基因编辑后的基因至患者的造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC），代替突变的HBB基因完成工作（图1）。

图1 β-地中海贫血基因治疗方法［3］Figure 1 Therapeutic Approaches forβ-thalassemia［3］

1 病毒载体介导的基因治疗

病毒载体介导的基因转移系统是目前使用最多的，常用的病毒载体包括逆转录病毒（retro virus，RV）、慢病毒（lentivirus，LV）和腺相关病毒（adeno associated virus，AAV）［4］。但是逆转录病毒载体存在一定的局限性和安全隐患，而腺相关病毒载体虽然安全性有所提高但不能包装较大的DNA。慢病毒载体可以稳定携带较大的基因如HBB基因，具有将复杂的基因结构转移到静止的造血干细胞中的能力，并且制备简单、安全性较好，因此慢病毒载体是目前β-地贫患者基因治疗最有效的基因治疗转移载体，它为β-地贫的基因治疗提供了可行性。

1.1 通过导入正常外源基因使体内产生正常的β-珠蛋白

通过将功能正常的HBB基因有效的导入患者的HSCs 中，使患者体内产生正常的β-珠蛋白，从而改善β-地贫患者的临床症状。2016年，Negre等［5］发现在β-地贫患者中通过慢病毒转移有标记的β-珠蛋白（βA-T87Q）基因进行的基因治疗可替代长期输血。2018年，Thompson 等［6］的研究中，在输血依赖型β-地中海贫血（Transfusion-Dependent β-Thalassemia，TDT）患者身上获得了自体CD34+细胞，在体外应用LentiGlobin BB305 载体编码携带T87Q 这一氨基酸取代的成人血红蛋白（HbAT87Q）。经转导和HSCs 移植，患者体内HbAT87Q在26 个月后逐步增加并稳定表达，其中3例β0/β0患者已停止输血，年平均输血量减少73%。这项临床试验的结果提示细胞基因治疗可能是地中海贫血治疗领域的发展趋势。

1.2 通过shRNA 敲低BCL11A 重新激活HBG 基因表达

Hb F 的构成为α2γ2，编码γ-珠蛋白的HBG基因在胎儿出生后逐渐关闭表达［7］。重新激活患者体内HBG基因的表达，是治疗或缓解地贫的一个重要策略［8］。HBG基因表达受多种调控元件调控，其中转录抑制因子BCL11A是影响其表达的重要因素［9］。但BCL11A在造血干细胞和祖细胞中的普遍敲除会损害移植后的造血重建。因此对BCL11A的红细胞特异性敲除可以避免移植造血干细胞的毒性［10］。Brendel 等［11-12］将shRNA（short hairpin RNA）嵌入microRNA（shRNAmiR）中，并将其与HBB基因启动子以及仅在红细胞前体中起作用的调节元件连接在一起，最后将其插入经过改造的慢病毒载体中。该研究表明，这种使BCL11A沉默的基因疗法既可促使HBG基因的重新激活，增加HbF 的表达水平，又可抑制镰状血红蛋白的表达。然而，红系谱系中BCL11A在B 淋巴细胞和造血干细胞的发育中起着至关重要的作用，BCL11A的完全失活会对人类红细胞的去核产生不利影响。相比之下，破坏BCL11A红系增强子中双等位基因上的GATAA 序列不会对去核产生负面影响［10］。因此，目前针对BCL11A基因调控的研究，主要集中在它的红系增强子上，以提供一种安全的治疗方法。

1.3 通过改变β-珠蛋白基因座的染色质结构重新激活HBG 基因表达

β-珠蛋白基因座的主要转录增强子，称为座位调控区（locus control region，LCR），由多个红系特异性DNaseⅠ超敏位点组成［2］。在红系细胞中，LCR 以发育阶段特异性方式接触类β-珠蛋白基因以刺激转录。通过染色质环化与HBG基因相互作用，这一过程需要蛋白质LDB1 的介导［13］。在成人红系细胞中，通过人工锌指蛋白将LDB1 连接到HBG基因启动子，这种方法诱使LCR 与HBG基因启动子之间形成了一个环，最终重新激活了内源性γ-珠蛋白的表达，同时降低了镰状血红蛋白的水平［14］。驱动染色质环化可以控制珠蛋白基因转录的平衡，尽管此方法目前只在小鼠和成人红系细胞中进行了研究，但提供了一种新的方法进行基因治疗。目前还需进行临床前的体内研究，探讨这种策略在人体体内的安全性和特异性。

2 基因编辑技术介导的基因治疗

在过去的几十年里，基因组编辑技术的发展已经可以在体外和体内对许多不同的细胞类型进行靶向修饰，并已开发出了多种基因编辑工具，包括锌指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）、转录激活样效应因子核酸酶（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）和成簇的规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/CRISPR 相关蛋白（CRISPR-associated proteins，Cas）系统［15］。基因编辑通过人工核酸内切酶精确靶向诱导DNA 双链断裂（DNA double-strand breaks，DSBs），激活细胞启动两种天然修复机制：同源重组修复（homologydirected repair，HDR）或非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ），对DSBs 进行修复［16］。

NHEJ 是一个高效的修复系统，在修复过程中能够在DSBs 位点产生碱基随机插入或缺失，最终引起蛋白质翻译的提前终止，从而抑制基因功能，实现目的基因的敲除。而HDR 是一种高保真的修复机制，使用同源DNA 作为修复模板，供体中的外源目的基因会通过同源重组过程完整的整合到靶位点，实现突变基因的校正［17-18］。虽然NHEJ介导的编辑效率比HDR 介导的编辑效率高，但HDR 修复方法可以实现精准的DNA 编辑。

2.1 对突变基因的原位修复

与慢病毒介导的基因疗法相似，基因编辑可用于对β-地贫患者的离体HSC 进行体外校正，以治疗β-地贫。理想情况下，可以通过HDR 对HSC中的HBB基因进行校正，从而产生健康的红细胞。Patsali 等［19］针对β-地贫中剪接异常进行了修复，通过破坏异常调控元件（disruption of aberrant regulatory elements，DARE）的方式，使用CRISPR/Cas9 和TALEN 工具对HBB基因上的IVS-I-110（G＞A）突变进行了修复。此外Xu 等［20］分别使用CRISPR/Cas9 和Cas12a 对β-地贫中常见的HBBIVS-I-110（G＞A）和IVS-2-256（C＞T）突变进行基因编辑，结果显示编辑过的患者造血干细胞的红系后代显示异常剪接的逆转和β-珠蛋白表达的恢复。

对于外显子突变需要精确修复才能恢复基因的正常功能。Liu 等［21］修复了β-地贫患者诱导多能干细胞（induced piuripotent stem cell，iPSC）中CD41/42（-TCTT）突变，经编辑后的细胞有HBBmRNA 的表达。而Wattanapanitch 等［22］利用CRISPR/Cas9 系统靶向修复了HbE/β-地贫患者来源的iPSC 中的CD26（G＞A）突变，但是研究发现HBBmRNA 和β-珠蛋白含量无明显上升，推测可能是由HBB基因表达需要的转录因子如BCL11A水平低而引起的。因此对于修复是否成功需要考虑到修复后的基因能否转录出正常的mRNA，并且翻译后能否产生正常的蛋白质。

针对像β-地贫这种主要由单碱基突变引起的遗传性疾病，除了用CRISPR/Cas9 技术进行原位修复外还可以通过单碱基编辑技术（base editors，BEs）对突变进行精确修复。Zeng 等［23］对HBB基因上的-28（A＞G）突变进行了单碱基编辑，结果显示有36.4%的突变实现了精确修复，虽然单碱基编辑介导的精确修复效率还需进一步提高，但是分化后的红细胞体积和形态都恢复至接近健康水平。该项研究表明单碱基编辑技术在造血干细胞的基因治疗应用中的巨大潜力，可以为β-地贫的临床治疗提供新的解决方案。

2.2 编辑r-珠蛋白阻遏物激活HbF 表达

Canver 等［24］发现BCL11A 上的红系增强子可作为HbF 重新产生的作用靶点。Wu 等［25］研究表明通过CRISPR/Cas9基因编辑技术编辑β-地贫和镰刀状贫血患者HSC 中的BCL11A 增强子的DNaseⅠ超敏位点+58，并进行自体HSC 移植，可以使得体内分化产生具有高比例HbF 及正常功能血红蛋白的红细胞，表明CRISPR/Cas9 介导的基因编辑技术有望治愈由β-珠蛋白突变引发的遗传疾病。

2.3 编辑HBG 基因阻遏物结合位点模拟HPFH突变

遗传性胎儿血红蛋白增高症（Hereditary persistence of fetal hemoglobin，HPFH）是一种良性血红蛋白病，该病的发生是由于基因缺陷使HBG基因在成年期都持续表达的结果［26］。Martyn 等［27］研究发现，HPFH 是由HBG基因转录起始点上游约115 bp 和200 bp 处的点突变引起的，突变破坏了转录抑制因子（BCL11A和ZBTB7A）与启动子的结合，从而使HBG基因表达。Wang 等［28］采用基因编辑技术模拟HBG启动子区13 bp 缺失和-114C＞T 这2种HPFH 中存在的突变，破坏了BCL11A结合域，从而解除对HBG表达的抑制，恢复HbF 水平，以达到治疗效果。此外，研究人员利用单碱基编辑技术直接作用于HBG基因启动子区，使-114 和-115 位点的C 突变为T，重新激活HbF 的表达。在Humbert等［29］使用非人灵长类动物模型，利用CRISPR-Cas9技术将相关基因修饰引入到特定的造血干细胞和祖 细 胞（hematopoietic stem and progenitor cells，HSPCs）亚群中，编辑后的细胞有效且稳定地重新激活了HbF，对治疗6 个月后的骨髓样本分析发现具有分化成完整的血细胞的功能。在一年半的监测期间没有发现对成熟血细胞有不利的影响。

3 β-地贫基因治疗的临床应用

近年来随着技术的快速发展，β-地贫的基因治疗临床应用也取得了显著进展。2019年慢病毒基因疗法Zynteglo，获得欧盟批准上市，这是全球首个获批用于治疗β-地贫的基因疗法［30］。2020年Zynteglo 在德国推出上市，这是该疗法的首次商用。Zynteglo 通过用BB305 慢病毒载体转导自体CD34+细胞，将修饰的β-珠蛋白基因的功能性拷贝添加到患者的HSC 中旨在纠正TDT 患者红系细胞中β/α-珠蛋白平衡。Zynteglo 在欧盟的批准下进行多项临床试验，在这些临床试验中，高达75%～80%的患者摆脱了对输血的依赖，已有患者近6年没有接受输血，和过去频繁的输血相比，是一个重大进步。但2021年2月，该临床试验已暂停，原因是曾经参加此临床试验的两名患者被诊断为急性髓细胞白血病和骨髓增生异常综合征［31］。虽然目前还不能明确这一症状与慢病毒基因疗法的关系，但是对于基因疗法的安全性问题至关重要，对临床试验必须要长期持续监测患者的安全性。

目前已经用于临床试验的CTX001 是针对患有严重β-地贫患者采用CRISPR 基因编辑技术的造血干细胞疗法。CTX001 通过剪切BCL11A基因来促进HbF 的产生从而实现治疗目的。该方法从患者体内分离出造血干细胞，在体外进行编辑，然后再回输到患者体内。2020年，Frangoul 等［32］报道的一例β-地贫患者在接受CTX001 治疗后，临床效果较好。在接受CTX001 治疗后，患者的HbF在入组临床试验时只有0.3 g/dL，治疗后3 个月后就升到8.4 g/dL，18 个月时就升到13.1 g/dL。在21.5 个月的随访期内，再也没有进行过输血。在该研究中，CTX001 对β-地贫体现了出色的治疗效果，整体安全性比较好，虽然随访时间还不够长，但这已经让“一次性治愈”初现希望。

4 结语与展望

地贫是全球分布最广、累计人数最多的一种单基因遗传病，主要发生在地中海沿岸国家和东南亚各国。全世界每年约有34 万名患有严重血红蛋白病的儿童出生，其中90%在发展中国家和低收入国家，给国家带来了巨大的公共卫生负担［33］。在我国，地中海贫血基因携带者高达3 000 万人，中重型地中海贫血病患者达30 万人，当前TDT 患者仍然有巨大的未被满足的医疗需求［34］。经过多年的研究，β-地中海贫血的治疗新纪元已经开始，β-地贫是非常理想的基因治疗适应症。针对不同的基因治疗策略，必须在效率、功效和安全性方面进行比较，以便为β-地中海贫血患者提供最佳的治疗选择。