卵巢癌组织中miR-183 表达及对癌细胞增殖和凋亡影响

张 英 宋晓红 郭海云

1.河北省张家口市妇幼保健院(075000)；2.北京世纪坛医院

miRNA是一类非编码的单链小分子RNA[1]。通过基因调控参加真核细胞生物学翻译过程。由于肿瘤与miRNA联系紧密，肿瘤miRNA研究成为热点[2-5]。以往研究显示，肝癌、胰腺癌等与miR-183在组织中的异常应答可能有紧密关联[3-5]。为探究miR-183的异常应答在卵巢癌发生发展中的影响，本研究对卵巢癌细胞中miR-183的表达水平和过表达对卵巢癌细胞的影响分析，探讨mir-183在卵巢癌发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 研究对象

经本院伦理委员会同意，选取本院2018年9月-2020年9月卵巢癌组织切片和其邻近组织切片标本40例,癌组织细胞为卵巢癌组织内细胞，癌旁组织细胞为卵巢癌组织范围2cm处没有癌变或坏死组织。患者手术前3个月没有接受任何药物或其他相关的抗癌治疗，均签署知情同意书。

1.2 细胞株以及试剂

中国科学院上海细胞库购进人卵巢腺癌细胞(SKOV3)和人卵巢癌细胞(OVCAR3)；上海素尔生物科技有限公司购入SH30809的RPMI-1640细胞培养基、SH30033的DMEM培养基、SH30084的胎牛血清(FBS)、SH30042的0.25%胰蛋白酶、SH30256的10xPBS；美国应用生物系统公司购买4366596的Taqman microRNA逆转录试剂盒、4324018的Taqman通用PCR主混合物；美国英杰生命技术有限公司购入15596-026的Trizol试剂、11668027的Lipofectamine 2000转染试剂；美国BD 公司购入556547的膜联蛋白v-fitc/pi凋亡检测试剂盒；西格玛奥德里奇公司购入M2128的噻唑蓝。

1.3 细胞培养以及转染

细胞培养：从液氮罐中取出两株SKOV3和OVCAR3细胞复苏，1200r/min离心3min弃上清，用1ml10% FBS的RPMI-1640培养基混匀，置培养瓶中，37℃ 5%CO2培养孵育。当细胞密度70%～80%时传代培养。细胞转染：合成MIR-183类似物和阴性对照类似物(表1)，严格按照美国英杰生命技术有限公司Lipofectamine 2000转染试剂说明进行细胞转染。

表1 miR-183序列信息

1.4 卵巢癌细胞系全RNA的抽提

将细胞培养皿置于冰上，加入Trizol试剂裂解5min，用加样器枪头轻轻吹打后吸取液体入EP管中；加入1/5体积氯仿混匀，4℃静置10～15min，4℃ 离心15min取上清。加入等体积异丙醇，4℃静置10min，12000rpm离心10min。取出EP管后避开侧壁沉淀，轻轻吸弃上清；向EP管中加入75%酒精洗涤，静置1～2min，4℃离心5min，轻轻吸弃上清；将EP管再次放于离心机中瞬时离心，弃掉管壁残余液体。将EP管置超净台中干燥5～10min。加入50μl DEPC处理水，震荡溶解沉淀。测量RNA浓度后-80℃保存。

1.5 荧光定量PCR和RNA的反转录

根据ABI公司Taqman microRNA逆转录试剂盒说明书进行，获得互补DNA(cDNA)产物。反应条件：16°C孵育30min，42°C孵育30min，85°C孵育5min，4°C储存。以获得的cDNA为模板，使用Taqman通用PCR主混合物20μl反应系统在罗氏Lightcycler 480仪器上行荧光定量PCR。u6为表达检测的内部参照物，△ct为mir-183相对表达(△CT=|CTmiR-183-CTU6|)。反应条件：在95°C时预处理10min，40×95°C 15s，60°C 30s，70°C30s循环周期。

1.6 MTT检测癌细胞增殖活力

将mir-183类似物和阴性对照类似物转染的细胞置96孔细胞培养板，每孔接种5×103个细胞；观察0h、24h、48h、72h细胞状态，每孔加入20μl 5 mg/LMTT，继续培养4h；取出96孔板，每孔加入120μl二甲基亚砜混匀，酶标仪检测570 nm处吸光度(OD值)为细胞增殖能力。

1.7 癌细胞凋亡率检测

将mir-183类似物和阴性对照类似物转染24h的人卵巢癌细胞用无血清培养基培养。将卵巢癌细胞1%CO2培育48h，用100μl 0.25%胰蛋白酶消化，将细胞收集于离心管中。避光加入5μl膜联蛋白V和5ul碘化丙啶，充分混匀，室温下无光孵育20min后用流式细胞仪对细胞进行分选检测。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 癌组织miR-183的表达

以U6作为癌细胞的内部对照，卵巢癌患者癌组织中miR-183(2.75±1.02)表达低于癌旁组织(5.43±1.27)(t=10.41,P<0.05)。

2.2 转染miR-183 mimics 的人卵巢癌细胞增殖活性

SKOV3和OVCAR3人卵巢癌细胞株依据转染情况，分为空白对照组(未转染microRNA)、阴性对照组(转染的拟态对照)与转染组(转染的mir-183拟态)。转染后0h、24h、48h、73h时MTT法测定细胞OD值。结果显示，在SKOV3细胞株中，24h时空白对照组和阴性对照组OD值均高于转染组(P<0.05)，但4个时间点阴性对照组和空白对照组OD值没有差别(P>0.05)。见表2；在OVCAR3细胞株中，48h时空白对照组和阴性对照组OD值均高于转染组(P<0.05)，阴性与空白对照组在4个时点OD值没有差别(P>0.05)。见表3。

表2 各时间点SKOV3细胞系OD值比较

表3 各时间点OVCAR3细胞系OD值比较

2.3 转染miR-183 mimics人卵巢癌细胞凋亡率

流式细胞仪结果显示(图1、图2，2485页)，在OVCAR3、SKOV3细胞株中，mir-183类似物转染48h后，细胞凋亡率空白和阴性对照组无差异(P>0.05)但均低于转染组(P<0.05)。见表4。

表4 各组细胞凋亡率比较

3 讨论

卵巢癌因其隐蔽发病致早期诊断困难，临床发现时70%以上患者为癌细胞转移，致使5年生存期<30%[6]。研究表明，肿瘤抑制基因p53的转录因子mir34b和mir-34c调控使卵巢癌发生[7]；mir-214影响卵巢癌转移[8]。miRNA通过调节基因表达，参与细胞分化与增殖[5，9]；介入细胞周期调节，参与细胞凋亡；调节靶基因表达，进行细胞内信号通路传递介入等[10]。有研究检测人卵巢癌细胞系和正常卵巢上皮细胞中miRNA表达谱，利用miRNA芯片技术共检测到miRNA173个，有160个在两个细胞系中有共同应答，但有35个应答有差异，其中31个下调、4个上调，且其中2个miRNA有肿瘤抑制作用，揭示了miRNA与卵巢癌的相关性[11]；有学者对106例早期和晚期卵巢癌患者miRNA表达，显示两组有44个非编码小分子RNA基因应答不同，晚期卵巢癌患者这44个miRNA基因应答下调，且包含有mir34a和mir15a抑制肿瘤功能基因，说明miRNA在卵巢癌的发展中发挥主要作用[12]。Iorio等[13]研究发现，上皮性卵巢肿瘤与正常卵巢组织存在不同表达的miRNA,通过对上皮性卵巢肿瘤中浆液性囊腺瘤、透明细胞中肾样瘤和卵巢子宫内膜样肿瘤的研究，证实了在肿瘤中存在miRNA的异常表达和突变,且发现miR-183家族成员中的miR-182在卵巢子宫内膜样肿瘤中存在特异性高表达。

在本研究，卵巢癌患者癌邻近组织内miR-183高于癌组织水平，说明卵巢癌组织中miR-183发生下调；在转染miR-183 mimics于SKOV3和OVCAR3人卵巢癌细胞株实验中，转染组人卵巢癌细胞增殖活性低于空白对照和阴性对照组，说明miR-183的过表达能够降低卵巢癌细胞增殖活性；在转染miR-183 mimics于SKOV3细胞系实验中，转染组人卵巢癌细胞凋亡率高于空白对照和阴性对照组，说明miR-183 能促进人卵巢癌细胞凋亡。在卵巢癌细胞中，miR-183的高表达破坏了卵巢癌细胞的正常生理功能。Fan等[14]发现在卵巢癌中miR-183同样能直接靶向作用于MMP-9，水平下降能抑制卵巢癌增殖，促进卵巢癌凋亡。近期Lee等[15]在子宫内膜癌研究中也证实了miR-183家族成员与抑癌基因PTEN的相关性。在卵巢癌组织中或某一组织类型卵巢肿瘤中, 过表达的miR-183家族成员对癌基因或抑癌基因的调节作用还有待进一步探讨。在卵巢癌中，miR-183的低水平表达，是卵巢癌相关基因或蛋白直接或间接与miR-183 发生作用，在转录水平或翻译水平负调控miR-183。一定程度上，miR-183 的表达水平越低，卵巢癌细胞的增殖能力越强。

综上所述，在卵巢癌发展过程中，miR-183发挥着重要调控作用，卵巢癌的增殖与凋亡与miR-183有紧密联系。对于卵巢癌组织中miR-183低水平表达有关机理仍需深入探讨，有望利用卵巢癌和miR-183这一关系理论应用于临床治疗卵巢癌。