青虾红肢病的病原鉴定及治疗研究

顾雪林，田丹阳，魏 宾，周晓东，钮 静，张茂友，宋学宏

(1.苏州市吴中区水产技术推广站，江苏 苏州 215104；2.苏州大学，江苏 苏州 215123；3.苏州市水产技术推广站，江苏 苏州 215006)

青虾因生长快、病害少、养殖成本低、经济效益稳定而受广大养殖户的喜爱，成为江苏省主推的水产养殖品种，其养殖面积及产量稳中有升。但近年来养殖者反映青虾也出现散发性死亡，附肢与身体发红，有时死亡率达30%～40%。青虾红肢病也称红体病、红头病、红体综合征，4－11 月是该病的流行季节，发病高峰为6－9 月，发病率为40%～60%，死亡率为15%～40%。2020 年8 月苏州市吴中区稻虾综合种养基地发生了红肢病，青虾出现零星死亡。抽样检查发现，附近70%的池塘发病，发病池中有10%～30%的青虾身体颜色变深，有的虾游泳足变为红色、腹部和尾扇微红、鳃部颜色变浅、肝区形状模糊、肠道无食、活力差，死亡率为10%～15%。本文对该虾病的病原进行了分离鉴定并开展了药敏试验，以期为生产上有效防控该病提供科学依据。

一、材料与分析

1.试验用青虾来源 病虾与健康试验虾分别来自苏州市吴中区稻虾综合种养基地的发病田与另一个未发病养殖户的青虾池塘。病虾规格为(2.32±0.74)克，健康虾规格为(2.13±1.03)克。

2.病原菌分离与纯化 取具典型红肢症状的患病青虾浸泡于75%的酒精中1 分钟，用无菌镊子打开病虾头部，取出肝胰腺至1 毫升LB 液体培养基中，连续吹打5次后100倍稀释，取50微升稀释液涂布平板，37℃培养过夜。再将分离到的细菌进行纯培养，用pH 7.2 的PBS 洗涤菌苔并稀释至2×104CFU/毫升，4℃保存用于后续的攻毒试验与分类鉴定。

3.病原菌的攻毒试验 将购回的健康虾放在圆形养殖桶(直径30 厘米、高40 厘米)曝气暂养1周后，取无病活泼的健康虾随机分入养殖桶，每桶6只，进行感染攻毒试验。在试验虾的第3肌节注射待检菌液20 微升/只，即4×102CFU/尾，对照组注射无菌生理盐水，剂量同试验组。每组设3个平行，饲养水温26℃，pH 7.8，观察青虾的发病情况，统计死亡数。

4.病原菌的分类鉴定 将分离纯化的细菌28℃培养24 小时后进行革兰氏染色和形态观察，纯培养物采用BBL Crystal微生物鉴定系统进行初步分类鉴定。然后委托金唯智生物科技有限公司进行细菌16S rDNA 测序，测序拼接的16S rDNA 基因序列的可变区V3～V4 片段经NCBI GeneBank 数据库进行Blast比对、构建分枝系统树，确认所分离细菌的分类地位。

5.药物敏感试验 采用动物用药敏分析试剂板(南京菲恩医疗科技有限公司)对分离的细菌纯培养物进行药物敏感试验。检测细菌对恩诺沙星、氟苯尼考、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟甲喹、盐酸多西环素、磺胺间甲氧嘧啶钠、磺胺甲唑＋甲氧苄啶等8种药物的敏感性。

6.发病虾的药物治疗 在病原体检验与药敏试验的同时对青虾进行了治疗，采用拌料口服盐酸多西环素1 克/千克饲料，连续5 天，全池泼洒苯扎溴铵1.5 克/米3两次，隔天1 次，同时泼洒1.5克/米3的过硫酸氢钾复合物进行改底。

二、结果与分析

1.病原菌的致病力 检查发现，病虾的游泳足变为红色、腹部和尾扇微红、鳃部颜色变浅、肝区形状模糊、肠道无食、活力差，病虾症状见图1A。从病虾肝胰腺中分离到两种菌，分别记作qx8151 和 qx8152，在水温 26℃、pH 7.8 的水环境条件下，将两株纯培养物分别以4×102CFU/尾的剂量攻毒后，qx8151 菌组在24 小时游泳足、腹部和尾扇呈红色，以及鳃部颜色变浅的典型症状，50% 以 上 死 亡 ， 至 48 小 时 死 亡 率 为 100% ；qx8152 菌感染后虾体色略显深灰色，在24 小时也出现少量死亡，死亡率为16.7%，到48小时死亡率为16.7%～33.3%，感染后发病症状见图1B～图1E。T 检验结果发现，空白组与生理盐水组无差异；qx8152 菌株组与生理盐水组也无显著差异，与空白组有差异(P＜0.05)，与qx8151菌组差异极显著(P＜0.01)；qx8151 菌组与所有组的差异均极显著(P＜0.01)(表1)。上述结果说明，qx8151 菌株的致病性非常强，qx8152 菌株的致病性远小于qx8151菌株，qx8152菌应为条件致病菌。

图1 发病的虾与致病菌感染后虾的发病症状

2.病原菌分类鉴定 从病虾肝胰腺中分离出的两种菌落qx8151 和qx8152，其中qx8151 的菌落小、圆形、边缘光整，培养24小时后的直径达1.0毫米左右，菌落呈乳白色半透明；菌落数占所有菌落的90%以上，细菌革兰氏染色阴性，弯杆状。qx8152 的菌落较qx8151 大、圆形、微凸、边缘整齐、表面光滑，培养24 小时后菌落直径达1.5～2.0 毫米，浅黄色半透明，菌落数占10%左右，革兰氏染色阴性，形状短杆状。

两株菌的纯培养物经BBL Crystal 微生物鉴定系统初步分类鉴定，结果显示菌株qx8151 与拟态弧菌(Vibrio mimicus)的相似度最高，可信度值为97.01%；菌株qx8152 与嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的相似度最高，可信度值为99.83%。两株纯培养物分离测序的16S rRNA基因通过Blast检索系统进行序列比对的结果显示，菌株qx8151 与拟态弧菌及霍乱弧菌的同源性最高，与拟态弧菌聚为1支；菌株qx8152与嗜水气单胞菌的同源性最高。综上所述，菌株qx8151 为拟态弧菌，菌株qx8152为嗜水气单胞菌。

3.药物敏感性与治疗效果 药敏试验检测拟态弧菌与嗜水气单胞菌对8种抗生素的敏感性，结果如表2～表4 所示，拟态弧菌对恩诺沙星、盐酸多西环素、氟甲喹的敏感性较强，0.10微克/毫升就能抑制拟态弧菌；磺胺间甲氧嘧啶钠、磺胺甲唑＋甲氧苄啶基本无效。嗜水气单胞菌对这8 种抗生素的敏感性明显小于拟态弧菌，只有0.78微克/毫升浓度的恩诺沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素能抑制嗜水气单胞菌，其他抗生素基本无效，可能嗜水气单胞菌对这些抗生素产生了抗性。

采取连续拌料口服盐酸多西环素药饵5天，全池泼洒苯扎溴铵、过硫酸氢钾复合物改底等治疗方案对发病池塘的青虾进行了治疗，结果在第3天青虾就从每亩死亡几百尾下降至10 多尾，第4 天停止死亡，取得了预期的治疗效果。

表1 病虾分离菌的纯培养物致病率

表2 拟态弧菌与嗜水气单胞菌的药物敏感性

表3 菌株对磺胺间甲氧嘧啶钠药物敏感性

表4 菌株对磺胺甲唑＋甲氧苄啶的药物敏感性

表4 菌株对磺胺甲唑＋甲氧苄啶的药物敏感性

拟态弧菌 嗜水气单胞菌药物浓度(微克/毫升)16/3.2＋8/1.6＋4/0.8＋2/0.4＋1/0.2＋药物浓度(微克/毫升)16/3.2＋8/1.6＋4/0.8＋2/0.4＋1/0.2＋

三、结论

1.病原菌的致病性较强 青虾红肢病或红体病是近年来青虾养殖中常发的疾病，发病季节是5－10 月，本次分离到的qx8151 菌株为拟态弧菌，菌落特征与生化检定结果与叶雪平等(2002)描述的一致，4×102CFU/尾的接种量在48 小时青虾全部死亡，其致死浓度远低于青虾980910株(叶雪平等分离)的攻毒浓度(5×104CFU/尾)，毒力较强。qx8152 菌株为嗜水气单胞菌，用4×102CFU/尾的攻毒量，青虾48小时的平均死亡率为27.3%，致病力相对较弱。

2.治疗方案 药敏试验结果说明，目前稻虾田块和池塘中的强毒株拟态弧菌对恩诺沙星、盐酸多西环素、氟甲喹敏感，弱毒株嗜水气单胞菌对恩诺沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素较敏感。根据体内外同时进行治疗策略以及治疗初步效果，建议用以下方法进行综合治疗，即采用拌料口服盐酸多西环素1 克/千克饲料，连续5 天，全池泼洒苯扎溴铵1.5 克/米3两次，隔天1 次，同时泼洒1.5克/米3的过硫酸氢钾复合物进行改底。