血浆Sema4D和MMP-9与膝关节骨性关节炎的相关性研究

王鑫

【摘要】 背景 骨性关节炎（OA）在我国患病率约为8.1%，是一种严重影响患者生活质量的关节退行性疾病，OA的诊断目前多依赖于病史、体征及影像学改变等，因此，探索血清学改变有助于OA的早期诊疗与预后。目的 研究血浆可溶性信号素4D（Sema4D）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）含量与老年膝骨性关节炎的相关性，评价血浆可溶性Sema4D和MMP-9对老年膝骨性关节炎诊断的参考价值及其对评价骨关节炎严重程度的临床价值。方法  选取2020年12月至2021年4月因骨关节炎就诊于中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院（第九四〇医院）的拟行膝关节置换术的患者32例为实验组;同期于第九四〇医院行健康体检的21例为对照组。使用酶联免疫吸附法分别测定实验组及对照组血浆可溶性Sema4D和MMP-9浓度，同时根据指南对实验组进行HSS评分及Kellgren & Lawrence分级。结果膝骨性关节炎患者血浆可溶性Sema4D和MMP-9浓度均高于健康对照组，两组间差异具有统计学意义;膝骨性关节炎患者血浆Sema4D浓度及MMP-9水平与HSS评分呈负相关，与Kellgren & Lawrence分级呈正相关。结论膝骨性关节炎患者血浆可溶性Sema4D和MMP-9均升高，血浆可溶性Sema4D和MMP-9均对膝骨性关节炎的诊断具有参考价值;血浆可溶性Sema4D和MMP-9浓度水平与HSS评分呈负相关，与Kellgren & Lawrence分级呈正相关，表明其对评价老年膝骨性關节炎严重程度具有临床价值。

【关键词】 骨关节炎;信号素4D;基质金属蛋白酶-9

中图分类号：R684.3

骨关节炎（OA）是一种关节软骨的退行性疾病，其病因尚不清楚。骨关节炎的发生与年龄、肥胖、炎症疾病、创伤和遗传因素等有关。其病理特征为关节软骨退行性变，软骨下骨硬化或囊性变，关节边缘骨增生，滑膜病变，关节囊挛缩，韧带松弛或挛缩，肌肉萎缩无力等。根据中国健康与养老追踪调查数据库的研究结果显示[1]，我国症状性膝关节骨关节炎（膝关节Kellgren & Lawrence分级≥II级，同时存在膝关节疼痛）的患病率为8.1% [2]。随着我国人口老龄化和肥胖人数的不断增加，骨关节炎的老年患病率正在不断增加。这从一定程度上给个人和社会导致巨大的经济负担，及时诊断及治疗骨关节炎已刻不容缓。信号素（Semaphorins）最初被定义为神经导向蛋白，信号素蛋白家族由20多种蛋白质组成，根据其结构及特征分为八个亚类。最近对信号素的研究表明，这些蛋白质可能发挥多种作用，包括调节免疫反应[3-4]、血管生成[5-6]、肿瘤转移[7-8]和骨代谢[9-11]。目前已有研究证实Sema4d基因敲除明显阻止了绝经后骨质疏松症小鼠模型中的骨丢失，Sema4D与其受体丛蛋白B1（Plexin-B1）在成骨细胞上的结合引起GTP酶的激活RhoA，通过抑制胰岛素样生长因子-1（IGF-1）信号，调节成骨细胞来抑制骨形成，这表明Sema4d是一种破骨细胞表达信号蛋白[12]。在骨性关节炎的发病机制中，其中一条主要机制即是关节细胞外基质（ECM）的过度降解。ECM 主要由II型胶原和蛋白聚糖聚合物组成，基质金属蛋白酶（MMP）参与II型胶原和蛋白聚糖聚合物的降解[13]。基质金属蛋白酶的激活导致导致关节ECM过度降解，从而参与骨关节炎的病理过程。本研究通过检测骨关节炎血浆中可溶性Sema4D和MMP-9的浓度，探讨血浆可溶性Sema4D和MMP-9浓度作为老年膝骨性关节炎及其严重程度评估指的可能性。

1 材料与方法

1.1 研究对象及分组

选取选取2020年12月至2021年4月因骨关节炎就诊于第九四〇医院拟行膝关节置换术的患者32例为实验组，其中男性14例，女性18例，平均年龄62.59±9.12岁;同期就诊行健康体检的人员21例为对照组，近期均无急慢性病史，入院常规检查无异常。其中男性13例，女性8例，平均年龄59.43±7.46岁。本研究已取得患者与患者家属的知情同意且获得第九四〇医院科研伦理委员会批准。

1.2 标本收集及处理

所有研究对象均采集入院第二天清晨空腹肘静脉血 8ml，4ml 分装于EDTA抗凝管中，于第九四〇医院检验科检测血常规、ESR（红细胞沉降率）、C反应蛋白、AST（天冬氨酸氨基转移酶）、ALT（丙氨酸氨基转移酶）、Scr（肌酐）、BUN（尿素氮），4ml 分装于EDTA抗凝管中，放入第九四〇医院骨科研究所（以下简称骨研所）实验室低温高速离心机中，在-4℃、3000转条件下离心10分钟取上清，取得的血浆标本存放于-80摄氏度冰箱内，检测时统一复融。

1.3 血浆可溶性Sema4D与MMP-9浓度的测定

采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被Sema4D、MMP-9抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP 标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物 TMB 显色，TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的Sema4D、MMP-9呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。

检测步骤：1.人可溶性 Sema4D 、MMP-9ELISA 检测试剂盒保存在骨研所-4℃冰箱内，使用前从室温平衡 20min后的铝箔袋中取出所需板条，蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水;2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品 50μL;3.样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL;空白孔不加。4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体 100μL，用封板膜封住反应孔，37℃恒温箱温育 60min;5. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置 1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次;6. 每孔加入底物溶液各50μL，37℃避光孵育15min;7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值;8.绘制标准曲线：以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

1.4 统计分析

本研究采用SPSS 21.0软件进行数据分析，符合正态分布计量资料采用均数±标准差表示，组间比较采用t检验或方差分析。不符合正态分布的计量资料采用中位数（四分位数）表示，组间比较采用秩和检验。计数资料以例数表示，组间比较采用卡方检验。相关性分析采用Spearman相关性分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基本临床资料的对比

骨关节炎组与同年龄组健康人群对照组在年龄、性别、血常规、ESR、C反应蛋白、AST、ALT、Scr、BUN水平等基础临床资料项目的差异无统计学意义（见表1）。

2.2两组间血浆Sema4D浓度、MMP-9浓度的比较

老年膝骨性关节炎患者组血浆可溶性Sema4D、MMP-9浓度高于对照组[11.71±1.53ng/mlvs10.11±2.49ng/ml，P<0.05;33.57±2.77ng/mlvs29.95±5.58，P<0.05]（见表2）。

2.3老年膝骨性关节炎患者血浆可溶性 Sema4D 水平、MMP水平与HSS评分的相关性分析

将血浆可溶性 Sema4D MMP水平与HSS评分、Kellgren & Lawrence分级做 Spearman 相关性分析。血浆可溶性Sema4D和MMP-9浓度水平与HSS评分呈负相关，与Kellgren & Lawrence分级呈正相关。其中血浆可溶性Sema4D和MMP-9浓度水平呈正相关（r=0.547，P<0.05）;与HSS评分呈负相关（r=-0.845，P<0.05）;与Kellgren & Lawrence分级呈正相关（r=0.516，P<0.05）。MMP-9浓度水平与HSS评分呈负相关（r=-0.407，P<0.05）;与Kellgren & Lawrence分级呈正相关（r=0.387，P<0.05）（见表3）。

3.讨论

骨关节炎是一种关节软骨的退行性疾病，软骨、滑膜、韧带及关节周围肌肉均发生病理改变，其中最先发生的是关节软骨的病理改变。关节软骨破坏分解后分解产物被释放入关节滑液，这些小颗粒被滑膜细胞吞噬，滑膜细胞通过血液循环及淋巴转运出软骨颗粒，导致滑膜炎进一步发展。滑膜细胞因炎症激活后释放可分解关节软骨的蛋白酶及促炎介质，而这些炎性细胞及参与关节软骨的分解蛋酶的增多，使关节软骨进一步破坏形成微小颗粒。这使得骨性关节炎的发展进入恶性循环[14]。关节内炎症使得炎症因子大量激活释放，如白介素-1（IL-1）等，多种炎性介质使得基质金属蛋白酶MMPs与基质金属蛋白酶抑制因子（TIMP）比例失调，最终引起软骨细胞外基质降解[15]。MMP-9又称明胶酶B，主要作用为降解细胞外基质[16]，参与多种生理及病理过程。当关节内炎症因子激活后，MMP-9大量释放，降解软骨基质细胞，破坏软骨结构。Sema4D是最初被发现在免疫细胞上表达的信号素，参与多种炎症因子介导的疾病。当炎症细胞激活后，其释放的基质金属蛋白酶可以切割Sema4D，使有活性的可溶性Sema4D释放入血，可溶性Sema4D与其相应的受体结合，参与免疫反应[17]。Sema4D最近是信号素家族的成员，目前已发现在免疫反应中具有重要作用，一旦Sema4D在炎症中被激活，分子量为120 kDa的可溶性Sema4D便从细胞膜上脱落并可在循环血液中检测到。目前多项研究均证实了Sema4D参与多种慢性炎症反应性疾病[18，19]。有研究发现破骨细胞中Sema4D的表达抑制了骨形成并且Sema4D通过其对生殖功能的影响间接调节骨吸收[20]。本文纳入因膝关节骨关节炎入院的患者，采用酶联免疫吸附法测定膝关节骨关节炎患者血浆可溶性Sema4D和MMP-9浓度，与健康体检者对照，二者浓度均明显升高，且血浆可溶性Sema4D和MMP-9浓度水平与HSS评分呈负相关，与AKellgren & Lawrence分级呈正相关。该结果表明血浆可溶性Sema4D和MMP-9浓度与膝关节骨关节炎及其严重程度均具有相关性。表明对骨性关节炎的诊断具有一定的参考价值，且对评价骨关节炎严重程度具有一定的临床价值。既往有研究证实骨性关节炎发生的进行性软骨破坏是基质金属蛋白酶活性增强的结果，该研究发现在大鼠右膝半月板撕裂模型中，每天两次以25mg/kg的剂量口服MMPI可显著抑制软骨退化和骨赘形成，故MMP的抑制作用能有效地减轻关节损伤，该研究亦反映出基质金属蛋白酶在骨关节炎的发生发展中具有重要作用[21]。陈德胜等通过观察人工全膝关节置换术的膝关节骨关节炎患者关节软骨中的MMP-9、VEGF表达升高，发现其与膝关节软骨退行性病变有关[22]。Takako 等通过动物模型研究发现抑制Sema4D–丛蛋白B1–RhoA信号轴可作为治疗骨关节疾病，包括骨质疏松症、骨关节炎、类风湿性关节炎的新途径（Negishi-Koga T ，  Shinohara M ，  Komatsu N ， et al. Suppression of bone formation by osteoclastic expression of semaphorin 4D[J].）。目前的研究已經证实了MMP可作为切割 Sema4D 细胞外结构域的第二种蛋白酶[23]，因此我们推测本研究中骨关节炎患者血浆可溶性Sema4D浓度较对照组高的原因可能与此有关。综上所述，骨关节炎发生后，各种炎症因子激活MMP-9释放，引起关节软骨破坏，而MMP-9将炎症细胞中的Sema4D切割，从而将可溶性Sema4D释放入血。可溶性Sema4D及MMP-9可能成为诊断老年膝骨性关节炎的参考指标，且可通过二者血浆中浓度检测骨关节炎的严重程度。

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