雏鸡小肠肠球菌分离鉴定及定量PCR检测方法的建立

邓云贵 ， 刘东海 ， 田宗旺 ， 魏国昊 ， 李 想 ， 王 琦 ， 王 瑾 ， 刘彦威，2 ， 刘 娜,2

(1. 河北工程大学生命科学与食品工程学院 ， 河北 邯郸 056038；2. 河北工程大学动物医学重点实验室 ， 河北 邯郸 056038)

小肠肠球菌为人兽共患的条件致病菌。在国外，1985年首次从生长受阻的雏鸡分离到。各日龄鸡均可发病，主要危害2～3周龄的雏鸡。临床表现为心内膜炎、败血症、脑软化、骨髓炎等[1]。一般分离率蛋鸡为8.8%，肉鸡为5.5%[2-3]，有的分离高达42%，死亡率为36%[4-5]，给养鸡业造成较大损失。在国内，有鹅、狐狸、猪等动物感染小肠肠球菌的报道[6-8]，还未见鸡只感染的报道。由于小肠肠球菌常引起胚胎感染而导致死胚和病、弱雏鸡，其病因往往归咎于鸡胚质量差、孵育条件不佳等因素[5]。因此，其致病机制和流行情况易被忽视。鉴于此，本试验从1日龄(刚出壳)病弱雏鸡肝脏中分离鉴定了小肠肠球菌，并建立快速检测方法，以期为鸡源小肠肠球菌病诊断和防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与设备 脑心浸出液(BHI)肉汤、营养琼脂培养基、D培养基-结晶紫-七叶苷琼脂、细菌基因组DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒、TaqPCR预混液，均购自北京索莱宝科技有限公司；SYBR Green I Premix Ex，购自天根生化科技有限公司。荧光定量PCR仪，购自德国耶拿分析仪器股份公司。

1.2 菌株与病料来源 对照菌株[粪肠球菌(Enterococcusfaecalis,Efa)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium,Efm)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum,EG)、禽肠球菌(Enterococcusavium,Eav)、盲肠肠球菌(Enterococcuscecorum,EC)、大肠杆菌(Escherichiacoli,E-co)、链球菌(Streptococcus,S)、沙门菌(Salmonella,SE)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,SA)]，均由河北工程大学动物医学重点实验室保存。病料采自病雏鸡内脏。

1.3 方法

1.3.1 病理学观察 对病雏进行剖检，观察内脏器官病变。取肝脏等器官组织，10%福尔马林固定48 h进行组织修块，经梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋，制成石蜡切片(5 μm),贴片后进行苏木精-伊红染色,树胶封片。显微镜观察。

1.3.2 分离株的培养 对病鸡进行剖检，无菌采集肝脏等器官组织，接种于营养琼脂，37 ℃恒温培养24 h。纯化培养，挑取单个菌落，接种于营养琼脂培养基，37 ℃恒温培养24 h，观察其菌落形态；菌落涂片，革兰染色，观察其菌体形态。挑取营养琼脂上单个菌落，接种胆盐七叶苷培养基，37 ℃恒温培养24 h，观察培养基颜色变化。

1.3.3 分离株16S rDNA 基因序列测序 提取DNA：挑取单个菌落，置于盛有1 mL营养肉汤的EP管中，37 ℃摇床增菌8 h。得到的菌液12 000 r/min离心2 min，弃上清加入1 mL灭菌水吹吸混匀，再离心、弃上清，加35 μL灭菌水，98 ℃水浴15 min，12 000 r/min离心1 min，收集上清液置于无菌EP管作为DNA模板备用，-20 ℃保存。

以分离株基因组DNA为模板,用16S rDNA通用引物(上游引物16S F：5′-CTAHAGGGTAT CTAATCCT-3′，下游引物16S R：5′-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)进行PCR扩增。PCR扩增反应体系(25 μL)：TaqPCR预混液(2×)12.5 μL,上、下游引物各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，用ddH2O补足至25 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸55 s，72 ℃中延伸7 min，共35个循环。用1%琼脂糖凝胶成像，将PCR产物送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序,测序结果与GenBank数据库中登录基因序列进行比对。

1.3.4 SYBR Green Ⅰ 荧光定量PCR检测方法建立

1.3.4.1 引物设计与合成 参考GenBank小肠肠球菌sodA基因编码区片段设计特异性引物，上游引物H1 5′-CTTTCTGATATGGATGCTGTC-3′(95～115 bp)，下游引物 H2 5′-TAAATTCTTCCTTAAATGTTG-3′(261～281 bp)，扩增片段的大小为187 bp。该引物和sodA基因测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3.4.2 SYBR Green Ⅰ定量PCR标准曲线的绘制 小肠肠球菌经脑心肉汤液体培养基培养后，调整菌液浓度为6.4×107CFU/mL，进行10倍系列稀释。提取各浓度梯度小肠肠球菌的基因组DNA。经定量PCR扩增后，以不同菌落数对数为横坐标，以PCR反应的循环数(Ct)为纵坐标绘制标准曲线。

采用25 μL反应体系：SYBR Premix ExTaq(2×)12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板1.0 μL，用ddH2O补足至25 μL。反应程序：95 ℃预变性4 min，94 ℃ 30 s，58.5 ℃ 30 s，72 ℃ 55 s，进行40个循环。待反应完成后，制作熔解曲线，采用系统软件进行分析。

1.3.4.3 敏感性试验 小肠肠球菌经脑心肉汤液体培养基培养后，调整菌液浓度分别为6.4×107CFU/mL，进行10倍系列稀释。提取各浓度梯度DNA，分别进行定量PCR和常规PCR。将常规PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，对比2种方法可检测出的最大稀释倍数，比较2种PCR方法的敏感性。

1.3.4.4 特异性试验 小肠肠球菌和对照菌株(粪肠球菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、禽肠球菌、盲肠肠球菌、大肠杆菌、链球菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌)基因组DNA为模板，同时进行定量PCR，检验其特异性。

1.3.4.5 重复性试验 选取2个稀释倍数基因组DNA，每个稀释倍数进行4个平行，进行定量PCR扩增，根据Ct值差异计算组内变异系数(CV%)，检验其稳定性。

2 结果

2.1 病雏鸡剖检及病理组织学观察 病弱雏鸡可见精神萎靡、闭目低头、腹部偏大。剖检可见肝脏呈土黄色(图1A)，卵黄吸收不良(图1B)。但肺脏、心脏、肾脏等器官无明显病变。显微镜下观察，可见肝脏组织充血、脂肪变性(图2A、2B)。

图1 病雏鸡剖检病变Fig.1 Lesions in autopsied chickA：肝脏呈土黄色; B：肝脏出血、淤血，卵黄吸收不良A: Liver was yellowish; B: Liver hemorrhage, congestion, and yolk malabsorption

图2 病雏鸡肝脏病理组织学观察(H.E.染色,40×)Fig.2 Histopathological observation of liver from diseased chick(H.E.staining,40×)A：肝脏充血、出血; B：肝脏脂肪变性A: Liver congestion and bleeding; B: Liver steatosis

2.2 分离菌株鉴定 在营养琼脂培养基上，菌落呈圆形、灰白色、微隆起、表面光滑的不透明菌落(图3)；在胆盐七叶苷琼脂上，培养基呈棕黑色(图4)；革兰染色为紫色，呈圆形，单在或成对存在的革兰阳性球菌(图5)。

图3 营养琼脂上菌落形态Fig.3 Morphology of bacterial colonies on nutrient agar

图4 胆盐七叶苷变色Fig.4 Discoloration of bile esculin agar

图5 革兰染色细菌形态(100×)Fig.5 Morphology of gram stained bacteria (100×)

16S rDNA通用引物进行 PCR扩增后，经基因测序得出碱基序列，将碱基序列于NCBI中比对，得出试验扩增序列与小肠肠球菌基因的相似度为99.36%。

2.3 小肠肠球菌引物特异性检测 特异性引物进行 PCR 扩增后，经琼脂糖凝胶电泳，形成1条单带，片段大小约为187 bp，与设计引物的预期基因片段大小相同。通过基因测序得出碱基序列，将碱基序列于NCBI中比对，得出试验扩增序列与小肠肠球菌基因的相似度为99.36%。

2.4 定量PCR线性范围与标准曲线 以小肠肠球菌6个稀释梯度的DNA为模板，进行定量PCR检测。以各浓度菌落数的对数为横坐标，以其对应的Ct值为纵坐标，作出标准曲线(图6)，可知模板DNA在6.4×101～6.4×106CFU/mL 6个浓度梯度呈良好的线性关系，回归曲线的斜率为-3.379，截距为37.04，相关系数R2为0.995 4。熔解曲线是单一波峰，Tm值均为83.2～83.6 ℃(图7)。

图6 小肠肠球菌SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR标准曲线Fig.6 Standard curve of SYBR Green Ⅰ quantitative fluorescence PCR for Enterococcus hirae

图7 小肠肠球菌SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR熔解曲线Fig.7 Fusion curve of SYBR Green Ⅰ fluorescence quantitative PCR for Enterococcus hirae

2.5 定量PCR敏感性 通过系列梯度稀释小肠肠球菌DNA模板，进行常规PCR检测，将可检测最小浓度进行比较。结果发现，定量PCR方法可以检测到6.4×101CFU/mL，常规PCR仅检测到6.4×103CFU/mL(图8、图9)。

图8 小肠肠球菌 SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR敏感性扩增曲线Fig.8 Sensitivity amplification curve of SYBR Green Ⅰ quantitative fluorescence PCR for Enterococcus hirae

图9 小肠肠球菌常规PCR敏感性电泳结果Fig.9 PCR sensitive electrophoresis results of Enterococcus hiraeM:DL-2 000 DNA相对分子质量标准； 1～6：浓度依次为6.4×106、6.4×105、6.4×104、6.4×103、6.4×102 CFU/mL和6.4×101 CFU/mLM:DL-2 000 DNA marker； 1-6：Concentrations were 6.4×106,6.4×105,6.4×104,6.4×103,6.4×102 CFU/mL and 6.4×101 CFU/mL, respectively

2.6 定量PCR特异性 从图10可知，只有小肠肠球菌出现特异性扩增曲线，而粪肠球菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、禽肠球菌、盲肠肠球菌、大肠杆菌、链球菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌均未起峰。

图10 小肠肠球菌 SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR特异性检测扩增曲线Fig.10 Specific amplification curve of SYBR Green Ⅰ fluorescence quantitative PCR for Enterococcus hirae

2.7 定量PCR重复性 将小肠肠球菌DNA 10 倍梯度稀释，挑选2个浓度用SYBR Green I荧光定量 PCR 反应分别进行4个重复试验，并根据反应后的Ct值计算组内变异系数(CV%)，结果显示同一个浓度梯度的4个重复中，扩增曲线和熔解曲线基本一致，从表1可知，2个浓度的Ct值的变异系数分别为3.3%和2.9%。

表1 小肠肠球菌Ct值变异系数Table 1 Ct value variation coefficient of Enterococcus hirae

3 讨论

John等(1985年)[9]首次报道小肠肠球菌可引起鸡的生长抑制，Devriese等(1991年)[10]报道小肠肠球菌引起3～8日龄的雏鸡败血症和脑局部软化坏死，表现出以斜颈为特征的神经症状。Hiroshi等(1997年)[11]在日本北海道某蛋鸡场发现小肠肠球菌感染引起腹泻，死亡率为3.53%。Kolbjornsen等(2011年)[12]在3周龄肉用仔鸡首次发现小肠肠球菌可引起细菌性骨髓炎[13]。Bernardino等(2019年)[13]研究了因小肠肠球菌引起的心内膜炎死亡的病例。小肠肠球菌为条件致病菌，主要危害幼雏，全球范围内流行，可引起多种疾病，导致多器官损伤，尤其心内膜炎感染病例，死亡率可达36%[14]，给养鸡业带来了严重的损失。对小肠肠球菌感染，国内只有人和鹅的病例报道[15]，尚未见鸡感染的相关报道。因此，弄清鸡小肠肠球菌感染情况，对本病防治至关重要。

本试验的分离株从刚出壳的病弱雏鸡的肝脏分离获得，经纯化培养后，在营养琼脂上形成圆形细小菌落，在七叶苷培养能产生黑色物质。在显微镜下，菌体为球形，革兰染色阳性。16S rDNA序列分析与GenBank的小肠肠球菌sodA基因编码区片段的相似性为99.36%，与其他菌株的同源性均低于95%。根据16S rDNA序列比对结果，结合菌落和菌体的形态，该分离株鉴定为小肠肠球菌。在试验过程中发现，刚出壳的病弱雏鸡可分离出多种病原菌，但均表现相似临床症状和病变，即没有典型示病症状和特征性病变，很难通过症状和病变判断病原菌的种类，因此，要确定感染病原菌种类，还需进行细菌分离鉴定。

以前报道大肠杆菌、沙门菌是造成病弱雏鸡主要原因，但近年来，研究结果显示肠球菌替代大肠杆菌、沙门菌，成为病弱雏鸡主要病原菌[16]。引起雏鸡感染的肠球菌有多种，不同肠球菌有不同防治措施，因此，有必要弄清感染肠球菌种类。细菌分离培养是鉴定肠球菌种类金标准，但分离鉴定耗时长，操作繁琐，缺乏时效性。而常规PCR检测方法虽相较于传统的细菌学检测方法更加快速、高效、特异性更好，但PCR产物需要经过琼脂糖凝胶电泳，其过程使用的显色剂(EB溶液)可致突变，污染较大[17]。近年来有国外研究者[18]利用环介导等温扩增技术(LAMP)对肉鸡心脏样品中的小肠肠球菌进行鉴定和定量检测。该方法特异性强、灵敏度高，但LAMP法扩增原理复杂，所需引物较多，引物设计要求较高，敏感性极高，反应后开盖极易形成气溶胶污染造成假阳性的结果。本试验采用SYBR Green I定量PCR检测方法可以检测到6.4×101CFU/mL，常规PCR仅检测到6.4×103CFU/mL；只有小肠肠球菌出现特异性扩增曲线，而粪肠球菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、禽肠球菌、盲肠肠球菌、大肠杆菌、链球菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌均未起峰；2个浓度，4次重复，变异系数小。本试验结果提示SYBR Green I定量PCR敏感性高、特异性强、重复性好，可以用于临床和食品样品小肠肠球菌的快速检测。