脂滴在弓形虫和艾美耳球虫感染过程的动力学及其功能

孙 霈 ， 王超越 ， 索 勋 ， 刘贤勇

(中国农业大学动物医学院 ， 北京 海淀 100193)

顶复门原虫(Phylum Apicomplexa)在宿主细胞的带虫空泡(Parasitophorous vacuole,PV)中完成增殖分裂时需要吸收宿主的营养物质，而脂滴作为一类重要的营养来源参与宿主与病原之间的相互作用。本文以顶复门(Phylum Apicomplexa)原虫中的龚地弓形虫(Toxoplasmagondii)和艾美耳球虫(Eimeriaspp.)为例，概述其在细胞内寄生时的脂滴动力学及其功能。

1 顶复门原虫对营养物质的吸收

顶复门原虫是一类专性胞内寄生的原虫，包括龚地龚地弓形虫(Toxoplasmagondii)、疟原虫(Plasmodium)、隐孢子虫(Cryptosporidium)、艾美耳球虫(Eimeria)等，能够引起严重的人和动物疾病。弓形虫是一种能够危害人畜健康的机会性原虫，常以假包囊(速殖子)和包囊(缓殖子)的形式寄生于几乎所有温血动物的有核细胞，可引起动物宿主流产以及视网膜炎症等，并且是导致免疫功能缺陷患者死亡的主要病原体之一[1]。而目前已发现的艾美耳球虫超过1 800种，其典型的球虫生活史发育过程与弓形虫相似。艾美耳球虫感染造成的球虫病给畜禽业造成巨大的经济损失。弓形虫及艾美耳球虫一旦“主动入侵”，会在胞内建立非融合的区域，即带虫空泡，并在其内完成生长增殖[2-5]。

顶复门原虫的带虫空泡不与宿主细胞器融合，但其所需的营养物质(如脂类物质)大多依赖于宿主细胞，而脂滴作为一类重要的营养来源参与宿主与病原之间的相互作用。关于这类寄生虫如何摄取宿主细胞的营养物质一直是研究的热点。目前的研究证明，顶复门原虫具有一套复杂的内化机制用于吸收宿主细胞内包括脂滴在内的营养物质[6]。本篇综述主要探讨顶复门原虫种的弓形虫摄取宿主细胞脂滴内化为自身营养物质的机制，也概述宿主限制弓形虫营养吸收的相关过程；同时还对艾美耳球虫脂滴相关研究结果进行阐述。

2 脂滴在寄生虫感染期间的动态变化

脂滴是一类球状的动态且复杂的细胞器，存在于几乎所有类型的细胞和生物体中，包括寄生虫、白细胞以及哺乳动物体内参与免疫反应的细胞[7]。其核心由中性脂质组成，主要是甘油三酯、胆固醇磷脂；核心外由一层单层磷脂分子及各种蛋白包裹[8]。脂滴与其他细胞结构如内质网、线粒体、过氧化物酶体、核内体等相互作用，能够调节脂质代谢，细胞信号传导，膜运输以及能量稳态等机体内活动；同时，脂滴活动受机体调节并可能根据刺激、细胞类型、激活状态和炎性环境而变化[7，9-12]。

近年来，研究发现包括病毒、细菌、寄生虫在内的一些病原微生物都能与脂滴相互作用。起初认为，病原微生物主要是利用脂滴来获得能量及脂质等来源，而近年来研究发现，脂滴也可以在病原微生物和宿主之间发挥媒介作用[7]。

弓形虫作为一类营养缺陷型寄生虫，它需要吸收宿主细胞内的物质并内化为自身生长所需的营养，进而完成生命周期。而同样在带虫空泡内寄生的艾美耳球虫，也需要依赖宿主的营养物质。但带虫空泡膜相当于一个分子筛，只能允许小于1 300 Da的分子(如维生素、核苷酸、氨基酸以及糖类)进入，这种结构能够直接限制寄生虫对大分子物质的摄取[13]。寄生虫如何内化脂滴这类分子量较大的物质？围绕这一问题，诸多科学家进行了探究。

研究发现，寄生虫在宿主细胞的寄生虫带虫空泡中复制时，寄生虫的增殖会诱发大量的脂滴生成[14]。弓形虫完成复制、增殖等生命活动需要脂类物质参与，但其自身无法从头合成胆固醇。研究发现，弓形虫能够将宿主脂滴内化到带虫空泡中，挽救脂质含量以合成自身的膜结构；或者在过量的情况下，将其存储在虫体自身的脂滴中以满足自己的营养需求[9]。在弓形虫感染期间，宿主细胞的脂滴数量会发生波动。最初，宿主细胞中的脂滴会聚集在带虫空泡膜附近，随着脂滴的数量逐渐增加，其峰值出现的时间与第1轮寄生虫复制(入侵后约8 h)有关；但寄生虫的高复制率需要该病原体能够从哺乳动物的内吞细胞器中高效回收这类脂质，随感染时间的延长，脂滴逐渐从宿主细胞内消失而内化为弓形虫体内的物质[15](图1)。

图1 弓形虫感染宿主细胞期间脂滴的分布

牛艾美耳球虫(E.bovis)体外培养时，通过免疫荧光能够观察到被感染的细胞内有大量的脂滴积累[16]。目前尚未观察艾美耳球虫感染期间脂滴的具体动态变化过程，但同属顶复门原虫的疟原虫、弓形虫等的相关报道为后续开展艾美耳球虫的脂滴研究工作建立了很好的平台[17]。

3 脂滴参与代谢

脂滴不仅是甘油三酯贮存和分解、花生四烯酸代谢和前列腺素合成的主要场所,而且具有合成甘油三酯和磷脂的功能。宿主脂滴脂质含量和脂解活性对于寄生虫在哺乳动物细胞中的发育非常重要[9，18]。

3.1 脂滴参与虫体的脂肪酸代谢 研究显示，脂滴为弓形虫速殖子发育提供脂肪酸和中性脂质[13]。但弓形虫内化宿主脂滴以及自身合成脂肪酸机制经过长期探索才得以解析。弓形虫能够通过多种途径利用宿主来源的脂肪酸。其中一部分脂肪酸能够通过脂肪酸合酶(即FASI和FASII)途径从宿主脂滴中获取，在感染期间截获宿主Rab7相关的脂滴并将其以胞吞途径捕获到带虫空泡中，使它们可被寄生虫内化吸收[7]。一旦脂滴由寄生虫内化，该寄生虫可以修饰宿主衍生的脂质，如胆固醇可以由2个酰基辅酶A酯化，通过胆固醇酰基转移酶(ACAT)以存储在胞质脂滴[15]。在龚地弓形虫中，FASII负责合成超过80%的饱和长链脂肪酸(LCFA)，脂肪酸的合成和摄取对于寄生虫的生长和发病机理具有重要作用，但由于 FASII途径不是哺乳动物细胞脂肪酸的主要来源，因此，开展弓形虫FASII代谢酶功能研究将为新型抗虫药物的研制提供理论基础。而另一部分脂肪酸则通过内质网中的脂肪酸延伸系统(ELO)，FASII合成途径中的一部分LCFA通过ELO途径被合成超长链脂肪酸(VLCFA)前体。之后的研究也发现，弓形虫可以利用其诱发的脂噬途径来弥补脂肪酸的不足。

通过比较基因组发现柔嫩艾美耳球虫基因组中有7种涉及Ⅱ型脂肪酸合成的酶；进一步利用免疫荧光以及电镜定位柔嫩艾美耳球虫脂肪酸生物合成酶(烯酰还原酶EtENR，Ⅱ型脂肪酸合酶的一种成分)，发现其定位于虫体顶质体[19-20]。目前的研究表明，EtENR可能是抗球虫药的特异性靶标[19]。

我们通过ToxoDB数据库比对以及查阅相关文献，发现弓形虫与艾美耳球虫的脂肪酸合成途径以及参与的相关酶相似(图2、表1)。相关数据提示我们，未来对艾美耳球虫脂肪酸合成及代谢的深入剖析可以参照弓形虫已有的研究工作。

表1 弓形虫脂肪酸合成和修饰的部分酶名称及艾美耳球虫基因号

图2 龚地弓形虫及球虫中脂滴代谢的关键酶及其分布KCR:酮脂酰-CoA还原酶； HCD:羟酰-CoA还原酶； ECR:烯酰-CoA还原酶； ACP:酰基载体蛋白； KAR:酮脂酰ACP还原酶； HAD:羟酰基CoA脱氢酶； ENR:烯醇还原酶； ACBP:酰基CoA结合蛋白； PPTase:磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶； ATAC:胆固醇酰基转移酶； ELO:脂肪酸延长酶； G3PAT:甘油-3-磷酸酰基转移酶

3.2 脂滴参与虫体的胆固醇代谢 有趣的是，不同的胆固醇营养缺陷性寄生虫似乎遵循不同的胆固醇清除策略，调节宿主细胞胆固醇的代谢是寄生虫特异性和/或宿主细胞特异性过程。众所周知，龚地弓形虫通过甲羟戊酸途径在从头合成胆固醇方面存在缺陷，它主要利用宿主细胞中的胆固醇(主要从低密度脂蛋白中获取胆固醇)。在弓形虫感染的细胞中，该过程独立于内质网和高尔基体，并且弓形虫内化的胆固醇能够均匀分布在虫体内。但当胆固醇过量时，寄生虫利用膜相关的ABC转运蛋白释放胆固醇和磷脂酰胆碱。

迄今为止，还没有针对任何艾美耳球虫属物种进行胆固醇获取的详细分析。有学者分析了牛艾美耳球虫对内皮宿主细胞胆固醇代谢的影响，发现与其他球虫存在显著差异。总体而言，在牛艾美耳球虫感染的宿主细胞中，游离胆固醇显著积累。在对牛艾美耳球虫的相关酶的研究中发现，最值得注意的是角鲨烯环氧酶(SQLE)的表达上调，已知其是甲羟戊酸途径中的限制性关键酶之一，而且该酶也在弓形虫感染的猪和人的宿主细胞中被诱导表达。此外，在牛艾美耳球虫感染的内皮宿主细胞中，胆固醇稳态调节的2个关键分子(INSIG1和SCAP)上调表达可能指向弓形虫中尚未描述的其他机制[21]。

有学者利用镰形艾美耳球虫(E.falciformis)为研究对象，利用转基因技术以及脂质组学等研究了镰形艾美耳球虫的磷脂组成和脂质生物发生的酶促网络，所述子孢子表达所有常见的甘油磷脂，如PtdCho、PtdEtn、PtdIns、PtdSer和PtdGro。镰形艾美耳球虫中某些脂类物质以及酶与包括弓形虫在内的其他原虫相似[17]。但目前尚未报道艾美耳球虫诱导脂滴积累的细胞类型及其感染期间脂滴的动态变化等内容。

4 脂滴能够限制寄生虫生长

与可以在宿主细胞质中自由扩散的小分子代谢物不同，摄取宿主脂肪酸(FAs)对胞内微生物构成了独特的挑战，原因有2个：(1)脂肪酸大部分被隔离为膜结合的脂滴；(2)线粒体的活动能够限制弓形虫脂肪酸的吸收。线粒体作为真核细胞的代谢中心，其是脂滴发生β-氧化生成脂肪酸的主要位置[14]。

作为类花生酸的主要来源，脂滴参与寄生虫诱导的炎症调控过程。在弓形虫感染的肌肉细胞和巨噬细胞中，脂滴的形成与COX-2和PGE2高表达相关，这可能有助于细胞分泌IL-12和干扰素IFN-γ，其中，IFN-γ对于控制弓形虫以及其他寄生虫的感染至关重要[7,22-23]。

有研究报道称，作为脂类降解的主场所——线粒体在人类多种疾病中都发挥作用[24]。专性的细胞内病原体依赖于宿主细胞的营养来维持生存，限制其获取特定营养素的能力会抑制其生长或诱发休眠状态。形态学观察显示，在弓形虫感染期间，宿主细胞线粒体会在带虫空泡附近伸长，而线粒体是脂滴发生β-氧化的场所，从而导致脂肪酸降解，这种途径会大大降低弓形虫对脂肪酸的吸收[24]。另有研究显示，弓形虫在自噬或甘油三酸酯贮库基因缺陷的宿主细胞中，脂肪酸的吸收和生长受到抑制；相反，在正常的宿主细胞中，弓形虫的脂肪酸摄取和增殖会相对增加[14]。由此我们猜测，宿主细胞可以通过影响线粒体的作用进而抑制弓形虫的生长，但其作用机理尚不清楚。另外，可以与胞内寄生的病原体竞争营养的宿主细胞器还包括内质网以及高尔基体等，但其通过何种机制限制弓形虫对营养物质的摄取仍是悬而未定的问题。

目前尚没有宿主自身细胞器参与并限制艾美耳球虫吸收及合成脂类物质进而影响其增殖的相关报道。但是通过外源加入一些能够限制脂类物质合成的化学试剂，如SOAT，ENR抑制剂等，能够明显限制艾美耳球虫在宿主细胞内的增殖[25]。

5 展望

宿主的脂滴在代谢、信号传导等过程中起主要作用，并积极参与先天免疫应答。已有研究证实，脂滴在宿主—寄生虫生物学中起着重要的作用，寄生虫与宿主的相互作用调节了2种生物的脂质代谢，这些研究为细胞生物学、免疫应答和药物开发提供了宝贵的知识。但目前脂滴的许多关键内容尚不清楚，例如在感染期间脂滴储存的脂类分子如何被调控？脂滴如何与其他细胞器相互作用？宿主通过什么机制限制寄生虫对脂类物质的摄取？所以对脂滴的深入探索，不仅能够弥补寄生虫的对营养内化吸收研究领域的短板，而且寄生虫和宿主脂质代谢的潜在差异可能为新型治疗药物的研发提供有希望的靶标。