不同性型水果黄瓜内过氧化物酶及同工酶的差异性分析

王鹤冰 向华丰 张洪成 张生

摘 要 为给水果黄瓜材料创制中性型的快速鉴定提供简易方法，以2对不同性型的水果黄瓜姊妹系为试验材料，比较分析其过氧化物酶活性和过氧化物同工酶电泳谱带的差异，结果表明雌性系材料中过氧化物酶活性明显较普通株系高，且同工酶电泳图中有明显的3条谱带。

关键词 水果黄瓜;性型;过氧化物酶;过氧化物同工酶;差异性

水果黄瓜又称迷你黄瓜、小黄瓜，是从欧洲引进的主要适宜温室栽培的鲜食类黄瓜品种，在很多地区作为名特优蔬菜被广泛引种栽培[1]。水果黄瓜作为黄瓜的一个分支，主要分布在英国、荷兰等地[2]。由于引种較晚，中国目前此类资源缺乏，生产用种多为外国品种。为提升国内的自主育种能力，近年来侧重在资源的搜集与创制上下文章。目前，我国引种的水果黄瓜品种多为雌性系，不能自交繁殖[3]，且制种过程较繁琐。为了培育出优良的水果黄瓜品种，创制出不同性型的水果黄瓜材料十分必要。

通过多年的材料引进与纯化筛选，我国不同类型的水果黄瓜材料逐渐增加，不同性型的育种材料也逐渐出现，但急需找到一个简单便捷的性型鉴定方法。

黄瓜材料性型的判断方法很多，最直观的方法是在生育期进行田间自然鉴定，但耗费时间长，受环境影响大。随着分子生物学研究的发展，分子标记技术逐渐应用于作物辅助育种，找到与所需性状密切相关的特异性分子标记，是在不同环境影响下，对作物复杂性状进行判断的有效途径。近年来分子标记在黄瓜雌性系选育中逐步应用，如厉建梅等用SSR 分子标记进行黄瓜雌性性状的多态性筛选，得到标记位点21个[4];苗晗等将F9代RILs群体用于复雌花QTL的定位分析，从中找到8个控制复雌花性状的QTL位点[5]。分子标记技术的发展也为后来雌性基因的定位奠定了基础。但无论哪个方法，对于常规的育种者来讲，都存在一定的局限性，因而研究还在进一步深入。

1995年，马蓉丽在进行黄瓜雌性系选育时，对黄瓜雌性系和其他品种粗浅地进行了种子萌动时期的过氧化物同工酶分析，发现雌性系与其他品种比较存在差异[6]，但未做进一步研究。之后此方面的研究也并未引起重视，但如果酶的差异可区分黄瓜材料的性型，将是一个快速的检测方法。

本试验以此为切入点，以不同性型的水果黄瓜姊妹系为试验材料进行研究，寻找不同性型水果黄瓜中过氧化物酶及同工酶的差异，以其为材料选择中性型的判断提供一个快速的评判方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以黄瓜课题组自己筛选纯化出的2对水果黄瓜姊妹系（A1-A2，B1-B2）为试验材料。性型类别见表1。

试验材料于春季在田间自然条件下播种、育苗，在植株3叶1心期进行取样，取叶片部分用于试验。

1.2 试验方法

1.2.1 材料性型的田间鉴定

为确定材料的性型稳定性与一致性，在田间自然条件下进行性型鉴定[7]。试验在春秋两季不同温度环境下进行，以消除温度对黄瓜性型分化的影响。

材料采取常规穴盘育苗方式，3叶1心时定植于露地，每份材料随机选取10株，调查其20节内的雌花节位。

1.2.2 过氧化物酶测定

过氧化物酶（POD）活性测定采用愈创木酚法[8]进行。

样品制备的步骤：称取0.2 g叶片组织，加入1 mL提取液，在冰浴上研磨成匀浆。于12 000 r?min-1、4 ℃条件下离心10 min，取上清液，置于冰面上待用。

1.2.3 过氧化物同工酶电泳分析

过氧化物同工酶电泳采用垂直板SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）技术[8]进行。

每个试验材料随机取样两份作为重复，进行同工酶电泳试验。

样品制备步骤：称取试验材料叶片0.5 g加入液氮研磨成粉末状，加入1.5 mL Tris-Hcl继续研磨成匀浆，倒入5 mL离心管中，再分次用2 mL Tris-Hcl将研钵冲洗干净转入离心管中。在11 000 r?min-1、4 ℃条件下离心20 min，取上清液（酶提取液），将其分装在2 mL离心管中与溴酚蓝（1.5 mL酶提取液+20 μL溴酚蓝）混合均匀后，置于-80 ℃冰箱储存备用。

2 结果与分析

2.1 雌性系材料的确定

因黄瓜的性型分化受温度影响较大，因而在试验进行前，再次对所选取的各水果黄瓜试验材料性型进行鉴定，确保后续试验材料性型具有代表性。

从表2的各材料平均雌花节位数统计可见，雌性系材料的雌花节位稳定，而普通株系在春秋两季的雌花节位数变化较大，在B2材料中秋季雌花节位数降低了16%。对各材料的雌花节率（见表3）进行计算，可见两对材料现状稳定，均为一个雌性系，一个普通株，其中A1为全雌株，雌花率100%，即无论在任何环境下均无雄花出现。

2.2 过氧化物酶活性分析

测定各材料的过氧化物酶，对2对材料的过氧化物酶活性进行比较分析，结果见图1。两对材料中，雌性系材料的过氧化物酶活性均明显高于普通株系，B1的酶活比B2高44%，而A1（全雌株类型的雌性系）的酶活更高，较对应的A2普通株系高56%。可见水果黄瓜中雌性比例越高，其过氧化物酶活性越强。但2对材料中雌性系与普通株间的过氧化物酶活性的临界值还有待进一步探索。

2.3 过氧化物同工酶谱带分析

从各材料的同工酶电泳图（见图2 ）中可清楚的看见，在每个姊妹系中，雌性系材料的同工酶谱带最后一条与普通株系均有明显差异。

雌性株系的同工酶谱有明显的3条条带，而普通株系只有2条明显的条带;在普通株系电泳图中，A2材料的第3条谱带颜色很淡，B2材料的第3条谱带甚至完全消失不见。

3 小结

性型在黄瓜育种中有着重要的地位，特别是当黄瓜育种工作由常规育种逐渐转向杂交育种后，雌性系更是因其简便易行的制种技术被育种者们在研究和利用中广泛青睐[9]。因而找到一个简易的材料鉴别方式对材料的选择十分必要。水果黄瓜材料中多数为雌性系，因而以其为试材，具有代表性。

抗氧化系统是植物抵抗逆境胁迫的重要防御系统，超氧化物歧化酶（SOD）、（过氧化氢酶）CAT和过氧化物酶（POD）是植物清除活性氧的重要抗氧化防御酶[10]。黄瓜的性型分化与温度关系密切，如温度在正常水平上升高，其雌花分化率明显降低，这可能与抗高温逆境胁迫有关，因此该试验就黄瓜雌性与POD间的相关性展开研究。

试验通过对水果黄瓜雌性系与其姊妹系的普通株系间的过氧化物酶活性及同工酶电泳谱带的比较分析，得到了水果黄瓜普通系与雌性系间过氧化物酶的明显差异，雌性系材料的过氧化物酶活性明显升高，且同工酶谱带有明显的3条;而普通株系中，过氧化物酶活性相对较低，且同工酶谱带只用2条清晰谱带，第3条谱带颜色很浅，甚至消失。

参考文献：

[1]  张显真，杨晓峰.温室水果黄瓜叶片生长规律研究[J].气象与减灾研究，2008，31（04）：43-47.

[2]  中国农业科学院蔬菜花卉研究所.中国蔬菜栽培学[M].北京：中国农业出版社，2009：624.

[3]  杨国志，袁偉，叶立华，等.水果黄瓜化学诱雄技术[J].浙江农业科学，2017，58（02）：209-210，213.

[4]  厉建梅，辛明，秦智伟，等.黄瓜雌性性状的QTL定位分析[J].东北农业大学学报，2012，43（10）：125-129.

[5]  苗晗，顾兴芳，张圣平，等.黄瓜复雌花性状QTL定位分析[J].园艺学报，2010，37（09）：1449-1455.

[6]  马蓉丽.黄瓜雌性系选育的研究[J].山西农业科学，1995，23（04）：35-38.

[7]  王鹤冰，向华丰，张洪成.黄瓜雌型材料筛选与留种技术研究[J].植物医生，2018（08）：22-23.

[8]  张志良，瞿伟菁，李小芳.植物生理学实验指导（3版）[M].北京：高等教育出版社.2009.

[9]  王鹤冰，向华丰，张生，等.中国黄瓜雌性系研究进展[J].中国农学通报，2015，31（10）：92-96.

[10] 王斌，朱世江.阶段降温对冷藏黄瓜耐冷性的诱导作用[J].江苏农业学报，2020，36（04）：1028-1035.

（责任编辑：敬廷桃）