水稻多胚基因CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建

陈强 何勇 田志宏

摘 要 为构建水稻多胚基因OsPE的CRISPR/Cas9基因编辑载体，以OsU6a启动子为模板，通过两轮Overlapping PCR构建出一个sgRNA的表达盒。在T4连接酶的作用下，将sgRNA表达盒连接到酶切后的CRISPR/Cas9编辑载体中。先进行菌液PCR验证和酶切验证，后通过测序检测，获得一套多胚基因的pYLCRISPR/Cas9-gRNA载体，为多胚基因的进一步研究提供新的路径。

关键词 水稻多胚基因;CRISPR/Cas9;基因编辑;载体构建

正常情况下水稻有性生殖的过程中只产生一个胚囊，一个胚囊只含有一个受精卵，受精后也只能发育一个胚[1]。通过自然进化产生的一些多胚性水稻，其种子无规律地分布在穗子中，且其不能够稳定遗传。水稻多胚基因OsPE是一个功能获得性的基因，位于水稻的第3条染色体上，cDNA全长2 755 bp，含有2个外显子，到目前为止，在水稻基因组中未发现OsPE的同源基因[2]。多胚基因在水稻杂交和加速育种等方面都有着重要的应用，种子由多到少，生殖由单一胚到二个胚乃至多个胚，可用于水稻多倍体的研究，通过加倍获得纯合的多倍体种子，加强育种优势，缩短育种需要的时间，同时可以节省母种、提高产量、改良品种等。发掘多胚基因的遗传机理，改良多胚基因的遗传稳定性是多胚基因发挥应用价值的重要前提。

基因组编辑技术是近几年兴起的一项能对基因组进行精确修饰的技术，通过使用核酸内切酶在基因组中可完成碱基的替换、插入、弥补小片段缺失等[3-4]。此外，具有转录抑制因子或激活因子的CRISPR/Cas9系统的修改版本，允许对靶基因进行强有力的转录抑制或激活[5]。CRISPR/Cas9主要由single-guide RNA和其引导的Cas9蛋白两部分组成，CRISPR/Cas9技术不仅适用性广，还可以同时进行多重靶向的编辑，且脱靶率比其他编辑方式低。近年来，基因编辑技术在水稻育种方面得到了大量应用，借助基因编辑的手段，通过T-DNA的插入，使基因序列发生一定的突变，能够获得一些稳定遗传的植物材料。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试大肠杆菌菌株DH10B和根癌农杆菌EHA105由本实验室保存，pYLCRISPR/Cas9基因编辑系统由华南农业大学刘耀光教授惠赠。实验中使用的高保真酶、质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒等购于南京诺唯赞生物科技有限公司。

1.2 靶点选择及引物设计

根据在NCBI中公布的水稻基因组序列，查找多胚基因OsPE的序列。利用在线软件CRISPR-P分析多胚基因的靶点特异性，在ORF功能结构区域筛选挑选合适的靶点，靶点的GC含量不低于40%，选择合适的Cas9靶点序列为T1：TGCTCTGTCTGAGTAAAGCA。利用Primer-5软件设计编辑引物，引物由擎科（武汉）生物科技有限公司合成，纯化级别PAGE。依據靶位点序列及sgRNA构建方法选择引物（见表1）。

1.3 sgRNA表达盒的构建

以pYLsgRNA-OsU6a/LacZ载体质粒为模板，通过两步Overlapping PCR往sgRNA表达盒中导入靶序列。第1步使用高保真DNA聚合酶构建一个10 μL的反应体系，在这个反应中使用4种引物，U-F和gR-R各0.5 μL，gRT1和OsU6aT1各0.25 μL。反应进行25个循环，95 ℃变性15 s;60 ℃退火15 s;72 ℃延伸45 s。第2步使用2种引物，Pps-GGL和Pgs-GGR各0.4 μmol·L-1，反应程序同上。对反应产物进行凝胶检测和测序检测。本实验表达盒由来源于水稻的RNA启动子U6a启动。

1.4 重组载体的构建与转化

利用限制性核酸内切酶BsaI识别位点与切割位点不重叠的特性，采用Golden gate cloning法构建双元载体[6-7]。选择适用于单子叶植物的pYLCRISPR/Cas9-Pubi-H载体，pYLCRISPR/Cas9质粒使用BsaI酶进行酶切，1 μg的质粒反应30 min，反应温度37 ℃，获得线性化载体。然后T4 DNA ligase对pYLCRISPR/Cas9质粒和上述gRNA表达盒进行连接，利用Golden gate cloning法将其克隆至pYLCRISPR/Cas9的BsaI位点。反应体系见表2。

反应程序：10 ℃反应5 min，20 ℃反应5 min，共进行15个循环。将重组产物用热激法转化至感受态大肠杆菌DH10B中，37 ℃平板涂布放置过夜，重组的载体质粒中含有卡那抗性基因，用含有50 mg·L-1的LB培养基筛选阳性菌落，也可以加入X-gal和IPTG进行蓝白斑筛选。

1.5 转化子的检测

挑取平板上的单克隆菌扩大培养，同时对菌落进行PCR检测，菌落PCR中使用的引物为CRISPRCX-F和CRISPRCX-R。反应程序：94 ℃预处理90 s，94 ℃高温变性20 s，56 ℃退火20 s，72 ℃片段延伸90 s，最后延伸5 min，共进行30个循环。凝胶电泳检测结果为阳性克隆，对阳性克隆分别进行2个靶点特异性引物CRISPRCX-F/OsU6aT1和gRT1/CRISPRCX-R的检测，PCR的反应程序与上面相同，检测阳性克隆的插入方向。挑选部分阳性克隆重组菌提取质粒，将重组质粒送擎科（武汉）生物科技有限公司进行测序，测序引物同上检测引物。

2 结果与分析

2.1 sgRNA表达盒的获取

用Overlapping PCR法通过特异性引物对pYLsgRNA-OsU6a/LacZ启动子质粒进行扩增，经过两轮PCR扩增，对第二轮PCR产物进行凝胶电泳，获得片段大小应为831 bp，凝胶电泳结果与预期相符（见图1），部分显示无条带可能与第二轮PCR底物浓度有关。

2.2 表达载体的获得与验证

对PCR产物直接进行回收，利用Golden gate cloning法将其连接到BsaI酶切后的载体CRISPR/Cas9中。提取转化菌的质粒，用MiuI酶切重组质粒鉴定是否连接成功，结果显示切出与预期大小相同的目的片段，表明已成功连接（见图2）。

CRISPR/Cas9系统有两个主要组成部分，其中一个是单一的引导RNA （sgRNA），它识别特定的DNA序列，以及在目标位点产生DSB的Cas9蛋白[8-10]，因此在改变sgRNA的设计时，可以灵活地选择多种位点。本研究中跟Cas9相关的基因由Pubi-H启动子驱动，而sgRNA则是由来源于水稻的U6a驱动[11]，以确保转录出的特异性单导RNA能够进入细胞核中与Cas9蛋白结合，构建的载体中用于水稻材料筛选的抗生素是潮霉素。载体图谱见图3，根据CRISPR/Cas9载体图谱改良。

2.3 转化菌的PCR检测

重组质粒转化DH10B后，挑取呈现出蓝斑的单菌落置于摇床放大培养，对阳性的单菌落进行PCR检测，使用引物CRISPRCX-F和CRISPRCX-R，得到大小亮度适合的片段，符合预期（见图4）。

同时对阳性单克隆进行一个潮霉素的PCR验证，得到大小约750 bp的片段，2号孔至11号孔都克隆出条带，表明部分表达载体成功转化进入大肠杆菌（见图5）。

挑取部分阳性克隆用特异性引物再次进行PCR验证，确定挑选菌的DNA链克隆插入方向（见图6）。将构建好的载体菌液送出测序，测序同样使用引物CRISPRCX-F和CRISPRCX-R，测序结果显示完全正确，多次检測表明载体pYLCRISPR/Cas9-gRNA-OsPE构建是成功的。将通过检测的pYLCRISPR/Cas9-gRNA载体质粒导入感受态的农杆菌EHA105中，获得的阳性克隆农杆菌即可用于侵染水稻愈伤材料。

3 讨论

CRISPR/Cas9载体系统作为一种新兴的基因编辑系统，在植物中已经有多例应用和验证，目前尚未有利用CRISPR/Cas9载体系统对多胚相关基因编辑的报道。CRISPR/Cas9基因编辑系统相对于其他编辑技术效率更加显著，且操作更便捷。相对于其他编辑技术，CRISPR/Cas9的编辑效率有了明显的提升，容错率也大大提高，且CRISPR/Cas9系统编辑不携带任何外源DNA，这是其他编辑方式所不具备的。

CRISPR-Cas9系统可编辑的位点在整个基因组范围内分布频率较高，很容易筛选出合适的靶点进行基因编辑。CRISPR-Cas9可以同时对基因组进行多位点编辑，大大提高了基因编辑的效率。该编辑系统的优势还在于其载体构建简单且靶向效率很高，只需要构建一个CRISPR sgRNA即可与DNA序列进行匹配，从而介导Cas9蛋白对DNA序列进行切割，同时可以更有效地去除假阳性。CRISPR/Cas系统是一种有效和通用的生物技术工具，将对基因组工程的未来发展产生重大影响[12]。

CRISPR的最终目的就是对其现有的基因组序列进行一系列编辑，通过外源T-DNA的插入，使水稻基因序列发生一定的突变，影响OsPE相关功能蛋白的合成和特定靶序列的识别，影响水稻外在的表型，最终得到突变的水稻植株，其后代种子发芽时可能出现两个或者多个胚。

本研究通过CRISPR/Cas9系统，先借助靶点特异性引物，经过两轮Overlapping PCR对U6启动子进行扩增，得到一个相应sgRNA的表达盒，然后用Golden gate cloning法将sgRNA表达框克隆到载体中相应的靶位点，经过多次检测与验证，最终获得了针对水稻多胚基因OsPE的pYLCRISPR/Cas9-gRNA编辑载体，为进一步利用基因编辑技术改良多胚基因的遗传育种奠定基础。

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（责任编辑：丁志祥）