落地生根冻干粉对人癌细胞增殖和细胞凋亡的影响

王雪纯 曹旭梅 陆莹 陈丽

摘  要：为初步研究落地生根冻干粉（BPFP）对人癌细胞增殖的影响，应用CCK-8实验检测不同质量浓度BPFP对人肝癌HepG2细胞、人脑胶质瘤U87细胞和人前列腺癌DU145细胞增殖的影响;用Hoechst 凋亡试剂盒检测不同质量浓度BPFP对细胞凋亡的影响.实验结果显示：BPFP对HepG2、U87和DU145细胞生长均有一定的抑制作用;BPFP作用48 h对HepG2细胞增殖抑制作用明显，抑制率在82%以上，其抑制程度与时间呈依赖性，但与剂量不呈依赖性;质量浓度为150 μg/mL以上作用48 h对U87细胞增殖抑制明显，增殖抑制率大于80%;质量浓度为250 μg/mL作用48 h对DU145增殖抑制作用最强，达到100%.BPFP作用24 h对HepG2、U87和DU145细胞凋亡均有一定的促进作用.实验结果提示，BPFP对HepG2、U87和DU145细胞的增殖有抑制作用，可能与BPFP能促进细胞凋亡有关.

关键词：落地生根冻干粉;细胞增殖;细胞凋亡;人肝癌HepG2细胞;人脑胶质瘤U87细胞;人前列腺癌DU145细胞

中图分类号：TQ460.7;R285.5        DOI：10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2021.01.002

0    引言

腫瘤的治疗到目前为止还没有十分令人满意的方法，采用手术、化疗和放疗等方法尽管有一定疗效，但常常对机体产生严重的毒副作用.近年来，中医药在癌症的治疗中已经起着不可忽视的作用.许多中药具有抗肿瘤[1-3]的作用，毒性小于化疗药物，对正常组织细胞伤害小，与化疗药合用具有减毒增效的作用[4].落地生根（Bryophyllum pinnatum （L.f.） Oken）是景天科（Crassulaceae）落地生根属（Bryophllurn Salisb）的一种多年生草本植物，在民间又有土三七、叶生根、花蝴蝶、番鬼牡丹或者天灯笼等别名[5].落地生根原产于非洲，现在我国多地区均有栽培，集中分布在云南、福建、台湾及两广地区，主要用于园艺观赏.落地生根价格低廉且易于栽培，全年均可采摘，全草可入药，性酸，苦，寒，归经肺、肾经，具有凉血、解毒消肿、拔毒生肌等功效，民间常用于止刀伤出血、咽喉肿痛、疔疮、溃疡或者中耳炎等[6].药理学研究发现，落地生根具有止血、镇痛、抗炎[7-8]、抗免疫[9]、抑菌[10-11]、抗氧化[12]等药理作用，但其抗肿瘤作用鲜有报道.广西是中草药资源大省，落地生根资源丰富，本课题通过研究落地生根冻干粉对肝癌HepG2细胞、人脑胶质瘤U87细胞和前列腺癌DU145细胞增殖的影响，初步筛选对落地生根敏感的肿瘤细胞，为进一步研究落地生根抗肿瘤作用提供初步实验依据.

1    材料

1.1    细胞

人肝癌HepG2细胞购于中科院细胞库;人脑胶质瘤U87细胞株和人前列腺癌DU145细胞购于武汉博士德生物工程有限公司.

1.2   实验试剂与药品

DMEM培养基、RPMI-1640培养基、PBS、胎牛血清（FBS）、链霉素和青霉素（PS）、胰酶均购于上海双洳生物科技有限公司;CCK-8试剂盒和Hoechst凋亡试剂盒购于上海碧云天生物科技有限公司.

落地生根：采自广西壮族自治区柳州市市郊，经广西科技大学医学部天然药物教研室陈君副教授鉴定为景天科（Crassulaceae）落地生根属（Bryophllurn Salisb）落地生根（Bryophyllum pinnatum （L.f.） Oken）.

落地生根冻干粉[13]及储备液配制：收集新鲜落地生根500 g，洗净晾干后用榨汁机榨汁，汁液冷冻干燥后得冻干粉（BPFP）3.25 g.用培养基溶解制成10 mg/mL（相当于生药量1 538.46 mg/mL）的储备液，用时用培养基稀释至所需质量浓度.

1.3    仪器设备

超净工作台（SW-CJ-2FD，苏州净化设备有限公司）;CO2恒温细胞培养箱（144415-20371，      美国Thermo公司）;荧光倒置显微镜（TS2-FL ECLIPSE，日本尼康株氏会社）;全波长扫描酶标板（Multiskan GO，美国Thermo公司）;立式高压灭菌器（LDZF-50L-Ⅱ，上海申安医疗器械厂）.

2    方法

2.1    细胞体外培养

HepG2细胞培养在含10%的胎牛血清、      100 U/mL链霉素和青霉素的DMEM完全培养基中;U87、DU145细胞分别培养在含10%的胎牛血清+ 100 U/mL链霉素和青霉素的RPMI-1640完全培养基中.细胞置于37 ℃、5% CO2恒温细胞培养箱中培养，待细胞处于指数增长期且融合度达到80%～90%时，可进行实验操作.

2.2    CCK-8法[14]检测BPFP对HepG2、 U87、 DU145细胞增殖的影响

分别将对数生长期的HepG2、U87、DU145细胞，按每孔5 000～7 000个细胞接种于96孔培养板中，每组设4个复孔.待细胞贴壁后，分别用          50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL、 250 μg/mL（分别相当于生药量7.69 μg/mL、15.38 μg/mL、23.08 μg/mL、30.77 μg/mL、38.46 mg/mL）的BPFP处理24 h、48 h和72 h，然后每孔加入10 μL CCK-8试剂培养2 h，用酶标仪在450 nm处测定OD值，按照式（1）计算BPFP对细胞生长的抑制率.实验重复3次.

（1）

2.3   Hoechst33258染色法[15]检BPFP对HepG2、U87、DU145细胞凋亡的影响

为了研究BPFP影响人癌细胞的增殖是否与细胞的凋亡有关，进行了细胞凋亡实验.将对数生长期的HepG2、U87和DU145细胞，按每孔约5 000个细胞接种于24孔板，细胞贴壁后分别用50 μg/mL、    100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL、250 μg/mL的BPFP处理24 h，吸出培养基，按照Hoechst凋亡试剂盒说明操作，每孔加入200 μL固定液，固定   10 min，吸弃固定液，用PBS洗去固定液，避光加入Hoechst 33258染色5 min，吸弃染色液，用PBS洗去Hoechst 33258，加入1 mL PBS，在荧光倒置显微镜下观察细胞凋亡情况.

2.4    数据处理

所有数据均以“均数±标准差”表示，采用SPSS 22.0统计软件进行数据处理分析，两组间差异比较采用t检验;采用GraphPad Prism 6.0软件进行实验图片处理.

3    结果

3.1    BPFP对肝癌HepG2细胞的影响

3.1.1    BPFP對HepG2细胞增殖的影响

图1是不同质量浓度的BPFP分别在24 h、   48 h和72 h对HepG2细胞增殖的影响结果.从图1中所显示的数据可看出，各质量浓度BPFP对HepG2作用24 h时，细胞生长被抑制，但抑制程度不明显;在作用48 h后，各质量浓度BPFP都能明显抑制HepG2细胞生长，但其抑制程度与时间、剂量不呈依赖性.

3.1.2    BPFP对HepG2细胞凋亡的影响

图2是HepG2细胞给予BPFP 24 h后加入Hoechst 33258染色在荧光倒置显微镜下所观察到的结果.Hoechst 33258染色后，活细胞形态为圆形或椭圆形的正常蓝色;而凋亡细胞因染色质固缩，其细胞核会呈致密浓染，颜色为亮蓝色.从图2可见，被固定住的细胞都已染色，与空白对照组 （0 μg/mL）比较，不同质量浓度BPFP处理后的HepG2细胞均不同程度出现亮蓝色荧光，且BPFP质量浓度越高，蓝色荧光越多且越明显，这提示

3.2     BPFP对人脑胶质瘤U87细胞增殖的影响

3.2.1    BPFP对U87细胞增殖的影响

图3是不同质量浓度的BPFP分别处理U87细胞24 h、48 h和72 h后细胞的生长抑制结果.由图3可见，在给药24 h内，BPFP对U87细胞增殖抑制 程度与作用剂量和时间呈依赖性;但在50 μg/mL时在不同时间点对细胞的生长抑制作用都不明显;在100 μg/mL作用72 h和150 μg/mL以上浓度作用48 h时对U87细胞增殖抑制作用明显增强，抑制率达80%以上，250 μg/mL作用72 h抑制率更是达到了100%.

3.2.2    BPFP对U87细胞凋亡的影响

图4是U87细胞给药24 h后经Hoechst 33258染色在荧光倒置显微镜下观察细胞的结果.随着BPFP质量浓度的增加，观察到了更多细胞的染色质浓缩、核碎裂和凋亡小体，说明细胞凋亡与质量浓度呈依赖性.

3.3    BPFP对前列腺癌DU145细胞增殖的影响

3.3.1   BPFP对DU145细胞增殖的影响

图5是不同质量浓度的BPFP处理DU145细胞24 h、48 h和72 h后细胞的生长抑制结果.由图5可见，BPFP对DU145细胞增殖抑制作用不具有时间依赖性，但对剂量具有一定依赖性.200 μg/mL以下质量浓度的BPFP对细胞增殖的抑制作用都不明显，但质量浓度达到250 μg/mL时对DU145细胞有明显的抑制作用，作用48 h后对DU145细胞生长的抑制率达到了100%.

3.3.2   BPFP对DU145细胞凋亡的影响

图6是DU145细胞经BPFP处理24 h并经Hoechst 33258染色后在荧光倒置显微镜下观察的结果.BPFP在质量浓度200 μg/mL以下观察到的凋亡细胞非常少，但质量浓度在250 μg/mL时亮蓝色荧光明显增强增多，说明凋亡细胞增多.

4    讨论与结论

通过实验发现，BPFP对HepG2、U87和DU  145细胞的增殖具有不同程度的抑制作用：不同质量浓度的BPFP处理HepG2细胞48 h后能够明显抑制细胞增殖，平均抑制率为87.33%;BPFP质量浓度为150 μg/mL及以上作用48 h后对U87细胞增殖抑制作用明显增强，平均抑制率达83.19%;BPFP质量浓度为250 μg/mL作用DU145细胞48 h后增殖抑制作用达到100%.实验结果表明，落地生根具有抗肿瘤作用，可作为抗肿瘤药物进一步开发和研究.

细胞凋亡是真核细胞重要的生物学现象，在肿瘤治疗中，诱导肿瘤细胞凋亡是重要的治疗策略[16].细胞发生凋亡时，最先改变的是体积缩小，连接消失，胞质密度增加，线粒体膜电位降低，通透性增加，细胞色素C释放到胞浆，核质浓缩，核膜核仁破碎，DNA降解为片段，形成凋亡小体[17]，最后被巨噬细胞吞噬.为了解BPFP抑制肿瘤细胞增殖的作用是否与细胞凋亡有关，本课题用Hoechst33258染色法观察了BPFP处理3种细胞24 h后的染色情况.Hoechst 33258是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，用于细胞核染色.BPFP处理3种癌细胞24 h后用Hoechst33258染色，都能不同程度观察到浓缩的核质及凋亡小体，细胞凋亡趋势与细胞增殖抑制率趋势一致.实验结果表明，落地生根能通过促进细胞凋亡而产生抗肿瘤的作用.

综上所述，落地生根对HepG2和DU145细胞的增殖抑制作用更为明显，具有潜在的抗肝癌和前列腺癌的作用，可能与BPFP促进了细胞凋亡有关.下一步，课题组将对落地生根抗肿瘤作用的有效成分进行筛选，对落地生根促进肿瘤细胞凋亡的机制作进一步的研究，同时寻找落地生根对敏感肿瘤细胞的共同作用靶点.

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