2 种佐剂在猪圆环病毒2 型基因工程亚单位疫苗中的效果比较

胡江锋，张志刚，董剑辉，陈 瑞，黄文强

（1.杨凌绿方生物工程有限公司 712100；2.陕西省兽用生物制品工程技术研究中心 712100；3.陕西诺威利华生物科技有限公司 712100）

猪圆环病毒（PCV）病是由猪圆环病毒引起的猪的一种多系统功能障碍性疾病[1]。 现已知PCV 有两个血清型，其中PCV1 为非致病性病毒，不会对感染猪造成危害；PCV2 为致病性病毒，感染可引起猪断奶后的多系统衰竭综合征（PMWS）、猪皮炎和肾病综合征(PDNS)、母猪繁殖障碍等多种相关疾病[2]。该病毒1974 年由德国学者Tischer 首先发现[3]，我国最早由朗洪武等于2001 年报道了PCV2 的存在[4]，目前，该病已普遍发生，给养猪业造成严重的经济损失[5]。 接种疫苗是预防该病的首要手段，而基因工程亚单位疫苗具有不会出现散毒、 同源重组以及发生变异的可能性等优点[6]，受到市场的关注，但相比传统的全病毒灭活苗或活疫苗， 由基因工程重组抗原组成的新型疫苗往往存在免疫原性弱等问题，需要免疫佐剂来增强其作用。 传统兽用疫苗中常用的佐剂有铝盐佐剂和油佐剂， 铝盐佐剂在诱导T 细胞及Th1 型反应中作用有限， 在同高纯度的小分子蛋白抗原共同使用时不能引起足够的抗体应答；油佐剂皮下注射会引起炎症、溃疡和肉芽肿，且不易代谢，很难适应新型疫苗的发展[7]。因此，本试验选用2种类型的新型佐剂制备猪圆环病毒2 型基因工程亚单位疫苗,并对其进行稳定性、黏度、安全及效力的检验与综合比较,以期为商品化猪圆环病毒2 型基因工程亚单位疫苗佐剂的选择提供借鉴与参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 抗原 病毒含量测定合格，且灭活完全的猪圆环病毒2 型基因工程亚单位疫苗抗原液，蛋白含量为720μg/mL，蛋白纯度为65%，由陕西诺威利华科技有限公司提供。

1.1.2 主要试剂 水包油佐剂Merckinade SDA25，购自赛德奥生物科技（北京）有限公司；双向佐剂Montanide ISA 206，购自赛彼科（上海）特殊化学品有限公司； 猪圆环病毒2 型PCR 检测试剂盒，购自青岛立见诊断技术发展中心；猪圆环病毒2-dCap-ELISA 抗体检测试剂盒及猪繁殖与呼吸综合征ELISA 抗体检测试剂盒，购自武汉科前生物股份有限公司。

1.1.3 试验动物 14～21 日龄的健康易感猪 （经猪圆环病毒2 型PCR 检测试剂盒检测PCV2 抗原为阴性、 猪圆环病毒2-dCap-ELISA 抗体检测试剂盒检测PCV2 抗体为阴性、 猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA 抗体检测试剂盒检测抗体为阴性），购自陕西省兴平市星光良种猪繁养殖有限公司。

1.2 方法

1.2.1 疫苗制备

1.2.1.1 Merckinade SDA25 佐剂疫苗：将灭活的抗原与Merckinade SDA25 佐剂按3∶1（质量比）准备，然后将灭活的抗原置于磁力搅拌器的烧杯中，开启磁力搅拌器达300r/min，缓缓加入Merckinade SDA 25 佐剂，在15℃～25℃乳化10min。

1.2.1.2 Montanide ISA 206 佐剂疫苗： 将灭活的抗原与Montanide ISA206 佐剂按1∶1 （质量比） 准备， 然后分别加热至30℃±2℃，将Montanide ISA206 佐剂倒入组织匀浆机中，以200r/min 搅拌，并将灭活抗原缓慢加入，待灭活的抗原加完后，提高搅拌速度至2000r/min，保持在30℃搅拌10min，接着一边将苗液逐渐冷却，一边逐渐降低搅拌速度，至15℃时停机，在15℃以下静置24h。

1.2.2 疫苗检验

1.2.2.1 稳定性检验 取两种疫苗各10mL 于离心管中，以3000r/min 离心15min。

1.2.2.2 黏度检验 两种疫苗均按现行 《中华人民共和国兽药典》方法[8]测定。

1.2.2.3 安全检验 将21 日龄PCV2 双阴性（抗原、抗体）及猪繁殖与呼吸综合征抗体为阴性的健康敏感猪15 头随机分为3组，每组5 头。其中一组按2.0mL/头于颈部肌肉注射Merckinade SDA25 佐剂疫苗；另一组按相同的方法、剂量注射Montanide ISA 206 佐剂疫苗；第三组以同样的方法、剂量注射生理盐水。 3 组猪分别隔离饲养，观察14 日内的体温及临床症状，结合14 日剖检的各脏器病理变化，判定疫苗安全性。

1.2.2.4 效力检验 将14 日龄PCV2 双阴性（抗原、抗体）及猪繁殖与呼吸综合征抗体为阴性的健康敏感猪15 头随机分为3组，每组5 头。 每种疫苗颈部肌肉注射一组实验猪，1.0mL/头，首免后14 日，以相同方式及剂量进行加强免疫一次，剩余一组实验猪不接种疫苗，作为对照。 3 组猪分别隔离饲养，加强免疫后21 日，15 头猪分别采血分离血清， 从1∶50 开始进行2 倍递增稀释血清至1∶6400，然后按猪圆环病毒2-dCap-ELISA 抗体检测试剂盒使用说明，制板、用酶标仪630nm 波长测各孔OD 值、计算（S-N）/（P-N）值、判定阴阳性、再确定各组实验猪PCV2 抗体效价。 需要注意，只有满足阴性对照OD630nm 均值＜0.3、阳性对照OD630nm 均值≥0.8 条件， 实验方为成立；S 为样品OD630nm值，P 为阳性对照OD630nm 均值，N 为阴性对照OD630nm 均值；样品结果判定: 样品（S-N）/（P-N）值≥0.16 为阳性；样品（S-N）/（P-N）值＜0.16 为阴性。

2 结果

2.1 稳定性 两种疫苗离心后均无水相析出

2.2 黏度

两种疫苗黏度均符合国家标准[9]（小于200cP）， 结果见表1。

表1 两种疫苗黏度检验结果

2.3 安全性

2.3.1 体温 接种后14 日内，两种疫苗安全检验猪及对照猪体温均正常，结果见表2。

表2 安全性试验接种试验猪体温测定结果（℃）

2.3.2 临床观察 接种后14 日内，两种疫苗接种猪的采食、饮水、精神状况均正常，均无不良临床反应，且疫苗吸收良好，注射部位均无红肿、硬块等局部异常反应，与对照组无明显差异。

2.3.3 剖检 接种后的14 日，剖杀所有实验猪，结果两种疫苗接种猪及对照猪的心、肝、脾、肺、肾、及淋巴结均无病理变化。

2.4 抗体效价

加强免疫后21 日， 用猪圆环病毒2 型ELISA 抗体检测试剂盒测定各组试验猪PCV2 抗体效价。 结果表明，Montanide ISA 206 佐剂疫苗免疫猪抗体效价不低于1∶3200；Merckinade SDA 25 佐剂疫苗免疫猪抗体效价介于1∶800～1∶1600； 对照猪抗体效价不高于1∶50，结果见表3。

表3 实验猪血清ELISA 抗体检测结果

3 结论

随着基因工程亚单位疫苗的深入研究， 其抗原不能诱导机体产生较强免疫应答的缺陷显现出来， 弥补这一缺陷常用的方法是选用合适的佐剂来刺激机体，提高机体对抗原的免疫应答，增强免疫效果。 通过本实验，笔者认为Montanide ISA 206 佐剂为猪圆环病毒2 型基因工程亚单位疫苗比较理想的佐剂， 它不但具有安全、无毒、粘度低、易吸收、无不良反应、增强免疫应答的特点，而且使用它，还可以节约抗原使用量，适合商品化、规模化生产的要求。