天然植物人参中糖醛酸含量测定方法的建立

朱明月，仝文科，杜红娜#， 苑军辉，张延华，杨 景，孔素叶，陆 安

（ 1.中农翎翔河北生物科技有限公司 050699；2.行唐县动物卫生监督所 050699；3.行唐县畜牧工作总站 050699；4.行唐县畜牧局动物疫病预防控制中心 050699；5.石家庄燕科生物科技有限公司 050200）

作为“东北三宝”之一的人参，在中国药用历史悠久。 人参中含有多种有效成分，但对人参的研究，多集中于人参皂苷。 近年来，关于人参多糖的报道越来越多，现代研究发现，人参多糖具有增强机体免疫力[1-6]和通过提高免疫力辅助抗肿瘤的作用[4-10]，显示多糖对人参药用价值的发挥亦起着重要作用。研究表明，人参多糖中的酸性多糖， 即含有糖醛酸结构单元的多糖生物活性较高[11]。 目前，药典“人参”饮片项下只有人参皂苷含量的测定方法，但未见人参中糖醛酸含量测定方法研究的报道。 因此，本试验拟建立一种准确可靠的人参中糖醛酸含量测定方法， 为人参饮片中人参多糖的质量控制提供可借鉴的分析方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器

UV2550 型紫外-可见分光光度计( 日本岛津)

AUW120D 型电子天平（日本SHIMADZU 公司）

1.2 药物与试剂

D-半乳糖醛酸对照品 （中国食品药品检定研究院， 批号：111646-200301，供含量测定用），四硼酸钠（美国Sigma 公司），间羟联苯（美国Sigma 公司），咔唑（北京化学试剂公司）， 其他试剂均为分析纯。

1.3 药材

人参药材购于安国药材市场， 经本公司质控部鉴别符合《中华人民共和国药典》2015 版（Ⅰ部）有关项下规定[12]。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

取人参细粉0.25g，置圆底烧瓶中，加80%乙醇150mL，加热回流1h，趁热滤过，残渣用80%热乙醇洗涤3 次，每次10mL，洗涤液弃去。将残渣及滤纸置烧瓶中，加水100mL，加热回流1h，滤过。残渣再加水100mL，加热回流1h，趁热滤过。残渣及烧瓶用热水洗涤4 次，每次10mL，合并滤液及洗涤液，放冷，转移至250mL 量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤纸过滤，取续滤液，即可。

2.2 对照品溶液的制备

称取D-半乳糖醛酸对照品10.08mg， 置100mL 量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 显色剂的配制

2.3.1 四硼酸钠-硫酸溶液的制备

称取四硼酸钠4.78g，置1000mL 量瓶中，加硫酸超声（功率250W，频率40kHz）使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得（0.0125 mol/L 四硼酸钠-硫酸溶液）。

2.3.2 间羟联苯溶液的制备

称取间羟联苯0.15g，置100mL 量瓶中，加0.5%的氢氧化钠溶液超声（功率250W，频率40kHz）使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得（0.15% 间羟联苯溶液）。

2.4 显色条件考察

2.4.1 最大吸收波长的选择

精密量取四硼酸钠-硫酸溶液6mL，置具塞试管中，于冰水浴中分别加入0.4mL 纯化水，摇匀，于冰水浴中，加入D-半乳糖醛酸对照品溶液0.6mL，摇匀，置沸水浴中加热12min，取出，置冰水浴中放冷至室温，加入间羟联苯溶液80μL，摇匀，室温放置40 min，以1mL 纯化水同上操作制得空白溶液调零，以紫外可见分光光度计，在400～700 nm 进行光谱扫描，结果显示，525nm 波长处吸光度值最大，因此，确定检测波长为525nm。

2.4.2 四硼酸钠-硫酸溶液用量考察

精密量取四硼酸钠-硫酸溶液3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL，分别置具塞试管中，于冰水浴中分别加入0.4mL 纯化水，摇匀，各加入D-半乳糖醛酸对照品溶液0.6mL，摇匀，其余操作同2.4.1 项，测定吸光度。结果显示：随着四硼酸钠-硫酸溶液用量的增加，D-半乳糖醛酸对照品溶液吸光度值先升高然后降低，其中以四硼酸钠-硫酸溶液用量为6mL 的吸光度值最大。 因此，确定四硼酸钠-硫酸溶液最佳用量为6mL。

2.4.3 沸水浴时间考察

精密量取四硼酸钠-硫酸溶液6mL，平行七份，分别置具塞试管中，于冰水浴中分别加入0.4mL 纯化水，摇匀，各加入D-半乳糖醛酸对照品溶液0.6mL，摇匀，置沸水浴中分别加热4min、6min、8min、10min、12min、14min、16min，其余操作同2.4.1 项，测定吸光度。 结果显示：沸水浴时间不同时，对照品溶液吸光度基本没有差异，说明沸水浴时间为4min 时，已反应完全。

2.4.4 间羟联苯用量考察

精密量取四硼酸钠-硫酸溶液6mL，平行十份，分别置具塞试管中，于冰水浴中分别加入0.4mL 纯化水，摇匀，各加入D-半乳糖醛酸对照品溶液0.6mL，摇匀，置沸水浴中加热4min，取出，置冰水浴中放冷至室温，再分别加入间羟联苯溶液30μL、40μL、50μL、60μL、70μL、80μL、90μL、100μL，摇匀，其余操作同2.4.1项，测定吸光度。 结果显示：随着间羟联苯用量的增加，对照品溶液吸光度值先增大后减小，其中以间羟联苯用量为80μL 的吸光度值最大，因此，确定间羟联苯最佳用量为80μL。

2.4.5 显色时间（室温放置时间）考察

精密量取四硼酸钠-硫酸溶液6mL，置具塞试管中，于冰水浴中加入0.5mL 纯化水，摇匀，加入D-半乳糖醛酸对照品溶液0.5mL，摇匀，置沸水浴中加热4min，取出，置冰水浴中放冷至室温，加入间羟联苯溶液80μL，摇匀，同法制备相应空白溶液，以紫外可见分光光度计，每隔5min 测定一次525nm 波长处的吸光度，连续测定60min。 结果显示：显色时间不同时，对照品溶液吸光度的RSD 值为0.30%，吸光度基本没有差异，说明显色5min即可。

2.5 供试品溶液制备方法考察

2.5.1 供试品溶液制备方法比较

为了考察人参皂苷对糖醛酸含量测定是否存在干扰，对80%乙醇醇提皂苷后再水提糖醛酸和直接水提糖醛酸的方法进行比较，光谱扫描图见图1。

图1 不同提取方法光谱扫描图

显色后颜色比较：醇提皂苷后再水提糖醛酸，供试品溶液显色后为砖红色；直接水提糖醛酸，供试品溶液颜色为咖啡色，两种供试品溶液制备方法显色后颜色不一致。 最大吸收波长比较：醇提皂苷后再水提糖醛酸，最大吸收波长为525nm，与对照品最大吸收波长一致，直接水提糖醛酸，最大吸收波长为508nm，与对照品最大吸收波长525nm 不一致。综上所述，若直接水提进行显色，则药材中人参皂苷对糖醛酸含量测定存在干扰。 因此，需醇提皂苷排除干扰后再水提糖醛酸进行检测。

2.5.2 醇提次数比较

对80%乙醇醇提皂苷的次数（1 次、2 次、3 次）进行了比较，结果显示：醇提次数不同时，供试品溶液显色后颜色一致，均为砖红色，且最大吸收波长均在525nm 附近，且糖醛酸含量差异较小，说明提取1 次，人参皂苷已提取完全，因此确定80%乙醇醇提次数为1 次。

2.5.3 溶剂用量考察

对糖醛酸提取溶剂 （水） 用量—50mL、100mL、150mL、200mL 进行了考察，结果显示：随着溶剂用量的增加，糖醛酸含量增高，但溶剂用量为100mL、150mL 和200mL 时，糖醛酸含量差异较小，因此，确定溶剂用量为100mL。

2.5.4 水提次数考察

对糖醛酸水提次数进行了考察，结果显示：随着水提次数的增加，糖醛酸含量增高，但水提2 次和3 次，糖醛酸含量差异较小，说明提取2 次，糖醛酸已提取完完全。 因此，确定水提次数为2 次。

2.6 标准曲线的制备

精密量取四硼酸钠-硫酸溶液6mL，置具塞试管中，平行六份， 于冰水浴中分别加入D-半乳糖醛酸对照品溶液0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL，以纯化水补足1.0mL，摇匀，置沸水浴中加热4min，取出，置冰水浴中放冷至室温，再分别加入间羟联苯溶液80μL，摇匀，室温放置5min，同法制备空白溶液，以紫外可见分光光度计，分别测定525nm 处的吸光度，并制备标准曲线，结果见图2。

图2 标准曲线

上述结果显示：以D-半乳糖醛酸浓度为横坐标(x)，吸光度为纵坐标(y) 作标准曲线，方程为y=0.0132x-0.0168(r=0.9997)，说明D-半乳糖醛酸溶液对照品溶液在10.08μg/mL～60.48μg/mL 范围内线性关系良好。

2.7 方法学考察

2.7.1 重复性考察

按取样量0.8∶1.0∶1.2 的比例分别称取样品，各平行三份，精密称定，按已确定的方法制备供试品溶液，并吸光度，计算糖醛酸含量。 九份样品测定结果RSD 值为2.26%， 该方法重复性良好。

表1 回收率考察结果

2.7.2 精密度考察

取对照品溶液及重复性考察项下的供试品溶液， 以间羟联苯法显色， 对对照品溶液和供试品溶液连续测定6 次525nm 处吸光度， 计算RSD 值。 对照品和供试品溶液RSD 值分别为0.08%和0.00%，该方法精密度良好。

2.7.3 稳定性考察

取对照品溶液及重复性考察项下的供试品溶液， 以间羟联苯法显色， 每隔30min 测定一次525nm 处的吸光度， 连续测定3h，计算RSD 值。 对照品和供试品溶液RSD 值分别为0.77%和2.15%，表明供试品溶液在3h 内显色稳定。

2.7.4 回收率考察

按取样量0.25g 的1/2 即0.125g 称取本品，精密称定，平行9 份，取已知浓度的的D-半乳糖醛酸对照品溶液，按照0.8∶1.0∶1.2 的比例分别加入样品溶液中，各平行三份，按确定的样品处理方法制备供试品溶液，以间羟联苯法测定糖醛酸含量，计算回收率及回收率的RSD 值。 结果见表1。

上述结果显示： 九份供试品溶液中，D-半乳糖醛酸回收率介于95%～105%之间， 回收率均值为100.49%，RSD 值为2.63%，该方法回收率良好。

2.8 人参多糖中糖醛酸的含量测定

精密称取人参细粉0.25 g，按照“2.1”项下供试品溶液制备方法和“2.4”项下显色条件显色，测定吸光度，计算供试品溶液中糖醛酸含量。结果人参中糖醛酸含量为3.99%，RSD 为1.23%（n=3）。

3 讨论

文献显示，糖醛酸含量测定方法分为“咔唑法”和“间羟联苯法”两种，咔唑法收载于《国家中成药汇编》中“人参多糖注射液”项下；间羟联苯法见于文献[13]，该文献报道咔唑法在测定人参酸性多糖中糖醛酸含量时， 因中性糖与硫酸咔唑络合形成棕色衍生物，从而对糖醛酸含量测定存在干扰。 笔者对咔唑法和间羟联苯法进行了比较，试验结果显示：采用间羟联苯法测定时，对照品溶液和供试品溶液最大吸收波长均为525nm， 且供试品溶液和对照品溶液均为紫红色；采用咔唑法测定时，对照品溶液最大吸收波长在525nm，而供试品溶液最大吸收波长在539nm，两者最大吸收波长不一致，对照品溶液为紫红色，而供试品溶液为咖啡色；且咔唑法和间羟联苯法相比，供试品溶液的吸光度咔唑法比间羟联苯法高0.286，说明咔唑法测定糖醛酸含量时，确实对测定结果的影响，同时验证间羟联苯法的可行性。 因此，确定人参饮片中糖醛酸含量测定方法为间羟联苯法。

供试品溶液制备方法考察过程中， 考虑到人参中含有皂苷和多糖两类成分，因此，笔者对皂苷是否对糖醛酸含量测定存在干扰进行了考察，结果发现，皂苷类成分存在时，间羟联苯法显色后，供试品溶液的颜色和最大吸收波长均存在差异，说明皂苷类成分的存在，对糖醛酸含量测定确实存在干扰。 因此，供试品溶液制备方法中确定先醇提除去人参皂苷，然后再水提多糖，以保证含量测定方法的准确度。

经多次试验验证，间羟联苯法测定人参饮片中糖醛酸含量，重复性好，准确度高，适用于人参饮片中糖醛酸含量的测定。 该方法可为药典 “人参” 饮片项下人参酸性多糖质量控制提供参考，以便更好地控制人参饮片质量。