非小细胞肺癌ERCC1、pp38表达与紫杉醇化疗敏感性及预后的相关性分析

汪 洋，王一娜，徐克明，冉安鹏，何 丹

（新疆医科大学附属肿瘤医院胸外科，乌鲁木齐830011）

在世界范围内，肺癌的发病率及死亡率较高[1]，在我国，肺癌的发病率也有逐年上升趋势[2]。多数早期非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者无任何症状，因此导致许多NSCLC患者在确诊时已非早期，需要术后辅助化疗[3]。已有学者发现，某些生物分子标志物对指导肿瘤患者个体化治疗有着至关重要的作用[4-5]，核苷酸切除修复交叉互补组1（excision repair cross complementing group 1，ERCC1）的表达可以作为铂类化疗敏感性的预测指标，影响患者预后[6-7]。此外p38信号通路被认为与肿瘤耐药密切相关。已有研究发现在人肺癌细胞中，p38信号通路能够诱导的MDM2降解进而导致紫杉醇耐药[8]。本研究拟以人肺癌细胞H1975为研究对象，探索p38信号通路与ERCC1之间是否存在调控关系，并通过免疫组化染色分析非小细胞肺癌肿瘤组织中磷酸化p38（phosphorylated p38，pp38）和ERCC1的相关性及对预后的影响，为临床NSCLC患者个体化治疗方案的选择提供依据。

1 材料和方法

1.1 试剂和抗体ERCC1购自Abcam公司。p38抑制剂BIRB796购自Selleckchem。pp38和p38抗体购自CST公司。人肺腺癌细胞H1975购自中国医学科学院上海细胞库。使用RPMI-1640培养液于37℃，5%CO2环境下常规培养，血清浓度为10%，青霉素浓度为100 U/mL，链霉素为0.1 mg/mL。紫杉醇及其他试剂购自Sigma Chemical公司。

1.2 CCK8增殖实验取对数生长期H1975细胞，用RPMI1640完全培养基制备成5×104个/mL单细胞悬液，分别接种至两个96孔板中。24 h后弃去旧培养基，分别加入不同药物处理组（紫杉醇与BIRB796抑制剂合用组需先加入BIRB796处理1 h后再加入紫杉醇)，设置空白对照与试剂背景孔，置于37℃培养12 h与24 h，吸干细胞培养基后加入10%CCK-8溶液，37℃孵育，1-2 h内酶标仪450 nm波长检测OD值。计算不同药物处理组对H1975细胞株的抑制率，抑制率（%）=（1-实验孔A值/空白对照孔A值）×100%。处理组包括：空白对照组、0.5µmol/L紫杉醇组、1µmol/L的紫杉醇组、10µmol/L BIRB796组、0.5µmol/L紫杉醇组+10µmol/L BIRB796组、1µmol/L的紫杉醇组+10µmol/L BIRB796组，以上共6组。

1.3 Western blot实验H1975细胞加RIPA裂解液（加蛋白酶抑制剂）裂解提取蛋白，BCA法测定浓度，95℃加热5 min。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白样品，转膜至PVDF膜，封闭1 h，一抗4℃孵育过夜，TBST洗3×5 min，二抗室温孵育1 h，洗膜后曝光显影。

1.4 RNA提取及real-time PCR在BIRB796和紫杉醇处理后，按照Trizol试剂盒说明书提取总RNA。ERCC1引物序列：5'-GGGTGACTGAATGTCTGACCA-3'；5'-GGGTACTTTCAAGAAGGGCTC-3'(reverse)for ERCC1。GAPDH引物序列：5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'；5'-GATCTCGCTCCTGGAAGATG-3'。荧光定量PCR程序：95℃5 min，95℃30 s，循环40次，60℃45 s，72℃30 min；每组设3个复孔，2-△△Ct法计算ERCC1的表达量。

1.5 一般资料筛选新疆医科大学附属肿瘤医院2012年1月1日—2015年12月31日，接受标准肺癌根治术(肺叶切除+系统性纵隔淋巴结清扫)的非小细胞肺癌鳞癌腺癌患者257例，进行电话随访。入选标准：未失访病例；未接受过术前放化疗；有癌组织和癌旁组织病理标本的患者。排除标准：资料不全者。符合上述标准的患者共124例。其中平均年龄64岁，男性77例，女性47例。I期患者43例，II期32例，III期48例（UICC2009版），鳞癌53例，腺癌71例。

1.6 术后随访124例NSCLC患者术后采取电话随访形式。随访时间自手术之日起，至2018年12月1日。终点事件为肿瘤复发和患者死亡。评价指标为患者1、2、3年的无病生存率（disease-free survival，DFS）和总生存率（overal survival，OS）。

1.7 免疫组织化学取非小细胞肺癌患者的肿瘤及正常组织，分别制成5µm的白片。脱蜡复水后，3%H2O2处理20分钟，抗原恢复10分钟。血清封闭液室温封闭30 min后，涂抗ERCC1、pp38抗体（1:200稀释）在4˚C孵育过夜。然后在37˚C用二抗孵育1 h。洗涤后，这些切片用链霉亲和素-生物复合物（strept avidin-biotin complex，SABC）制剂处理，并进行3-二氨基联苯胺（diaminobezidin 3，DAB）着色。苏木精(Sigma)染色，脱水，二甲苯清除，中性树脂封片，显微镜下观察。

1.8 结果判定切片由病理科两位高级职称医师随机独立阅片后，取平均分。评分标准参考H-score评分法，即：每张切片随机观察5个高倍（×400）视野并计数100个肿瘤细胞。采用细胞显色强度评分与阳性肿瘤细胞百分比的乘积求得半定量H-score评分，作为蛋白表达相对强度。具体评分方法为：1.按显色程度分4级：阴性（不着色）、弱阳性（淡黄色）、阳性（棕黄色）、强阳性（棕褐色），分别计0、1、2、3分；2.阳性肿瘤细胞百分比：0%~5%计0分；5%~25%计1分；26%~50%计2分；51%~75%计3分；＞75%计4分。

1.9 统计学方法采用SPSS20.0软件进行统计分析，一般临床资料比较采用χ2检验和非参数Wilcoxon秩和检验，相关性分析采用Spearman等级相关分析。生存分析采用Kaplan-Meier法中Log-Rank检验。多因素分析采用Cox回归模型向前法。所有细胞实验至少重复3次，统计方法采用t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 ERCC1的表达和H1975细胞对紫杉醇的敏感性在H1975细胞中ERCC1蛋白和mRNA水平的表达随紫杉醇浓度和时间依赖性的增高，当加入10µmol/Lp38抑制剂BIRB796后，ERCC1的表达显著被抑制，见图1A、1B和1C。CCK8增殖实验结果显示在BIRB796联合0.5µmol/L、1µmol/L紫杉醇干预12 h和24 h组中，H1975细胞的抑制率均显著高于0.5µmol/L、1µmol/L紫杉醇处理组（P＜0.05），见图1D。

2.2 癌组织中的ERCC1和pp38与临床资料的相关性鳞癌组织中ERCC1的表达率（79.2%，42/53例）高于腺癌组织（42.1%，37/71例）。在组织学分级方面ERCC1随着分化程度的降低，ERCC1的表达呈增高趋势。鳞癌组织中pp38的表达率（78.9%，56/71例）高于腺癌组织（62.3%，33/53例）。肿瘤组织中ERCC1、pp38的表达率与年龄、性别、病理分期、T分期、N分期差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

图1 p38信号通路靶向调控ERCC1的表达并增强了H1975细胞对紫杉醇的敏感性

表1 非小细胞肺癌患者的临床病理特征及肿瘤组织中ERCC1和pp38的表达

2.3 肿瘤组织中pp38、ERCC1的表达ERCC1、pp38在鳞癌和腺癌组织强阳性结果，ERCC1染色定位于细胞核内，pp38染色定位于细胞核和部分胞浆内（图2A）。ERCC1和pp38癌组织中位评分为均为6分。ERCC1和pp38癌组织中的表达均显著高于癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.001），见图2B。肿瘤组织中ERCC1和pp38的H-score呈正相关（r=0.660），见图2C。

图2 pp38、ERCC1在癌组织和癌旁组织的表达

2.4 ERCC1和pp38对NSCLC患者预后的影响ERCC1阳性的患者1、2、3年的OS率（92.0%、73.10%和70.80%）显著低于ERCC1阴性的患者（97.10%、91.20%、85.10%），P=0.029。然而pp38的表达则未显示出有生存差异。ERCC1、pp38在肿瘤中表达对预后差异均无统计学意义（P＞0.05），见表2和图3。此外，Cox回归多因素生存分析结果显示，ERCC1、组织学分级、pTNM分期是影响患者OS的独立因素，见表3。

表2 ERCC1和pp38对非小细胞肺癌患者的预后影响

图3 ERCC1、pp38对非小细胞肺癌患者预后的影响

表3 Cox多因素分析NSCLC患者总生存期

3 讨论

肺癌是世界范围内最常见的癌症之一。手术、化放疗和靶向治疗为其主要的治疗方式。但由于化疗药物耐药性的产生，肺癌的缓解率被限制在40 %~50%。第三代化疗药物（如紫杉醇、吉西他滨等）联合顺铂的两药联合方案已成为局部晚期或术前术后辅助化疗的一线治疗方案[9-10]。紫杉醇是目前最常用的广谱化疗药物，主要通过破坏微管的动力学平衡，促进微管聚合，抑制解聚导致癌细胞死亡[11]。临床上经常使用多西他赛联合顺铂，延长非小细胞肺癌患者的生存期。紫杉醇在化学治疗中被广泛使用，但紫杉醇耐药性产生是严重影响患者预后的重要因素之一，探索其耐药性产生的分子机制对改善患者预后有着至关重要的作用。

ERCC1在DNA修复过程中有重要作用，有学者研究表明，对于肿瘤患者ERCC1低表达比高表达的患者生存期更长，预后更好[12]。还有学者发现ERCC1高表达与紫杉醇类化疗药物敏感性相关[13]，p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK）与细胞的增殖、分化、死亡调控等过程密切相关，是体内十分重要的信号通路，p38 MAPK能够调控上皮细胞向间质细胞的转变（epithelialto mesenchymal transition，EMT）而影响肺癌侵袭和转移[14-15]。对紫杉醇耐药的非小细胞肺癌细胞的研究显示p38 MAPK活化增加，p38 MAPK活化能抑制肿瘤细胞凋亡[16-17]。本课题研究首次发现p38信号通路对ERCC1具有调控作用。在H1975细胞中ERCC1蛋白和mRNA水平的表达随紫杉醇浓度和时间依赖性的增高，当加入10µmol/Lp38抑制剂BIRB796后，ERCC1的表达显著被抑制。CCK8增殖实验结果显示在BIRB796联合0.5µmol/L、1µmol/L紫杉醇干预12 h和24 h组中，H1975细胞的抑制率均显著高于0.5µmol/L和1µmol/L紫杉醇处理组（P＜0.05）。提示，ERCC1是p38信号通路了的下游调控蛋白，阻断p38信号通路能够增强H1975对紫杉醇的敏感性。

本研究结果显示ERCC1和pp38癌组织中的表达均显著高于癌旁组织，这与文献[18-19]研究结果一致，有学者研究表明ERCC1高表达组患者总生存率及无病生存率高于ERCC1低表达组[20-21]，本课题结果显示ERCC1对NSCLC术后患者OS差异有统计学意义，但DFS差异无统计学意义。分析其原因可能是ERCC1表达差异导致了NSCLC患者对术后辅助化疗的敏感性差异，从而引起OS生存期的显著差异。pp38表达与NSCLC术后患者预后无关，原因可能是pp38只是作为单一信号传导通路，其下游调控分子蛋白才是细胞功能表型直接效应蛋白。本研究通过检测分析对比患者肿瘤组织及正常组织中ERCC1、pp38的表达水平及与患者生存预后的关系，揭示了ERCC1和p38信号通路之间的密切关联，在一定程度上证实了ERCC1对于非小细胞肺癌患者的生存趋势以及化疗药物的选择是有预测价值的。

综上所述，本研究初步证实ERCC1是p38信号通路的下游调控蛋白，阻断p38信号通路能够增强H1975对紫杉醇的敏感性。pp38、ERCC1在癌组织的表达均高于癌旁组织且具有正相关性。ERCC1是影响NSCLC术后患者总生存期的重要因素。