天麻对乳酸菌发酵过程中氨基酸代谢的影响研究

黄先敏，孙建美，范 莉，张可满

（昭通学院 农学与生命科学学院，云南 昭通 657000）

天麻（Gastrodia elata.Bl.）属于兰科异养植物[1]。无根、叶，通过消化吸收蜜环菌的菌丝获取营养。传统上天麻常作为药用[2]，用于中医治疗疾病已有2000 多年的历史[3]。天麻中含有天麻素、天麻多糖、天麻苷元[4]、蛋白质及氨基酸等有效成分[5-6]。现代药理研究表明，天麻具有镇静、催眠、抗惊厥[7]、提高免疫力及改善记忆力等多种作用，并且对治疗各种晕眩有显著的疗效[8]。在心血管方面，有降低血压、抗凝血、抗血小板聚集及脑缺血保护作用[9-12]。天麻产量的增加和作为药食两用物质的确定[13]，为开发天麻的其它用途提供了保障。天麻在人体及其它动物上研究运用较多，在微生物上的研究报道较少，能否影响微生物代谢情况的报道还未曾有过。

乳酸菌（Lactic acid bacteria）是一类能发酵碳水化合物，产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌的总称。保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）是乳酸菌类的益生菌[14]。保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌间有互惠共生作用，二者混合作为发酵乳制品的重要发酵剂菌种而被广泛应用[15]。乳酸菌具有调节胃肠道菌群平衡，促进食物消化，维持微生态平衡，提升机体对营养物质的吸收[16]，增强机体免疫力及延缓人体衰老等功能[17]；同时具有抑制肿瘤[18]，降低血清中的胆固醇含量，调节血压等重要的生理活性[19]。

本实验在乳酸菌的培养基中加入天麻提取液，以添加纯净水为对照，通过肉眼对乳酸菌在两种培养基中的发酵过程观察，制作临时装片进行显微观察，收集不同发酵时间段内的发酵液，测定其中的氨基酸含量，通过含量间的差异性比较，以此来确定天麻提取液对乳酸菌发酵过程中氨基酸代谢的影响，为天麻在其它领域和行业的开发应用提供一些思路和方法。

1 材料和方法

1.1 实验材料的来源

乳酸菌菌种：嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌混合菌种（来源于来思尔裸酸奶，云南皇氏来思尔乳业有限公司生产）；天麻（昭通市神农乌天麻良种繁育有限公司提供）；纯牛奶（昆明雪兰牛奶有限责任公司）；乳蔗糖（云南楚雄禄丰县平浪镇舍资街）。

1.2 实验方法

本论文以在乳酸菌培养基中加入纯净水为对照（CK），对添加天麻提取液的乳酸菌培养基中的氨基酸含量进行测定分析，氨基酸含量采用茚三酮显色测定法，实验设置样品重复6 次，在570 nm 的波长下进行测定，对测定的结果进行方差分析。

1.2.1 天麻提取液的制备

准确称取20 g 天麻粉（过80 目筛），加入200 mL 纯净水，用FA25 高剪切分散乳化机搅拌均匀，转速10000 r/min，时间10 min，将混合液倒入离心管内，在AK/GL-20B 型高速冷冻离心机内离心，转速8800 r/min，时间10 min，上清液为天麻提取液，备用。

1.2.2 培养基的制作

添加天麻提取液的培养基配方：加入纯牛奶500 g、白砂糖67 g、天麻提取液132 g 混合均匀。CK 的配方：加入纯牛奶500 g、白砂糖67 g、纯净水132 g 混合均匀。在这两种培养基中分别加入来思尔裸酸奶100 g，利用其中的乳酸菌（嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌）进行发酵。

1.2.3 乳酸菌发酵的过程观察

将上述两种的培养基放在温度为40 ℃，相对湿度50%，在光照下，进行发酵培养，然后每隔20 min 观察一次培养基，根据培养基的组织形态及质构变化，收集0、80、140、160、200、240、360、420、500、600、740 min 时间段的发酵液作为实验材料。

1.2.4 样品溶液的制备

取1.2.4 所收集不同时间段的发酵液5 mL，放入锥形瓶中，再加入10 mL 娃哈哈纯净水，放在恒温水浴锅中，沸水浴30 min，取出后室温冷却，定容到25 mL 的容量瓶中，将定容后的溶液进行抽滤，取滤液备用。

1.2.5 样品溶液的测定

取样品溶液0.2 mL，加入2%的茚三酮溶液0.4 mL 和pH5.6[20]的磷酸缓冲液溶液0.2 mL,充分摇匀，沸水浴15 min，取出后，立即放入装有自来水的烧杯中，冷却至室温，再加入4.8 mL 纯净水。然后以纯净水为空白对照，用紫外-分光光度计在570 nm 的波长下测定其吸光度。

1.2.6 氨基酸标准曲线的绘制

标准溶液的配制：称取0.1 g 谷氨酸加纯净水溶解，定容到100 mL 容量瓶中，配成1 mg/mL的母液。再从中取0、1、2、4、8、10 mL 母液于25 mL 的烧杯中，分别加入20、19、18、16、12、10 mL 纯净水配成0、50、100、200、400、500 μg/mL 的标准溶液。

标准曲线的制作：分别取2.7.1 所述标准溶液0.2 mL，加2%的茚三酮溶液0.4 mL，pH5.6 的磷酸缓冲液0.2 mL，沸水浴15 min 取出后，放入装有自来水的烧杯中，冷却至室温后，加入4.8 mL纯净水。溶液中的质量浓度为0、2、4、8、16、20 μg/mL，在波长为570 nm下,测定溶液的吸光度。以吸光度为横坐标，质量浓度为纵坐标，得氨基酸的标准曲线，如下图。

从图1 中可见，吸光度与质量浓度间的线性关系式为y=17.827x+0.0676（R2=0.9968），表明在0～20 μg/mL 的质量浓度范围内，吸光度与质量浓度呈良好的线性关系。

图1 氨基酸的标准曲线图

1.2.7 仪器的精密度、准确性及重复性实验

取未发酵的CK 培养基，参照1.2.5 和1.2.6 的步骤进行处理，测其吸光度，重复6 次，计算其RSD 值为2.972%，可知仪器的精密度高，实验的准确性和重复性好。

2 结果

2.1 两种乳酸菌培养液的显微结构

图2 CK 中乳酸菌的显微图图（放大倍数400 倍）

从图中可以看出，添加天麻提取液的发酵液中，嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的细胞相对于未添加天麻提取液中的细胞大。两者嗜热链球菌呈分散的颗粒状，保加利亚乳杆菌呈短杆状。

用添加天麻提取液的发酵液和添加纯净水的发酵液制作装片，在显微镜下，观察其发酵液中乳酸菌的显微结构，如下图。

图3 添加天麻提取液乳酸菌的显微图

2.2 不同发酵时间段培养液的组织型态结构情况

将制作好的培养基放在温度为40 ℃，相对湿度50%，光照下进行发酵培养。每隔20 min 观察一次培养基，将有明显组织型态结构变化的发酵液记录下来，结果见表1。

表1 不同时间段发酵液的情况

从表1 中可以看出，添加天麻的发酵液在0 ～160 min 时呈乳白色的液体状，随着发酵时间的延长，到200 min 时发酵液开始出现粘稠感，240 min 时粘稠感增强，边缘开始出现凝固状态，420 min时呈半凝固状态，500 min时液体完全凝固，直至到600 min 时开始出现分层现象，700 min 分层现象比较明显。CK 发酵液在0 ～200 min 时呈乳白色的液体状态，240 min 开始有粘稠感，随着时间的延长，360 min 时粘稠感逐渐增强，边缘开始凝固，有胶质感，420 min 开始呈半凝固状态，500 min 时呈半凝固状态，600 min 液体完全凝固，700 min 开始出现分层现象。

2.3 不同发酵时间段的氨基酸的含量

将添加天麻的乳酸菌发酵液和未添加天麻的乳酸菌发酵液在570 nm 的波长下，测其吸光度，经计算可得不同发酵时间段发酵液中氨基酸的含量（mg/L），结果见表2。

表2 不同发酵时间段中氨基酸含量（mg/L）

从表2 中可以看出，添加天麻提取液的起始氨基酸含量为1146.04 mg/L，CK 为609.80 mg/L，添加天麻提取液的起始氨基酸含量高于CK 含量536.24 mg/L，是因为天麻中含有氨基酸的量为29.090 mg/g[21]，所以在发酵起始阶段，添加天麻提取液中的氨基酸含量高于对照中的含量。随着发酵时间的进行，添加天麻的乳酸菌在360 min 时，氨基酸含量为556.63 mg/L 是为最低点，CK 在240 min时到达含量的最低点，为264.03 mg/L，可见，添加天麻能延长乳酸菌对氨基酸的利用时间。到达最低点后，随发酵时间的延长，氨基酸的含量不断增加，在740 min 时含量到达最高点。

为了更加直观清晰地表达出两种发酵液中氨基酸的含量变化情况，以时间为横坐标，不同发酵时间段的氨基酸含量为纵坐标，做成氨基酸含量的变化曲线图，见图4。从图4 中可以看出，添加天麻提取液中的氨基酸含量在0 ～360 min 时，呈下降趋势，CK 中氨基酸的含量在0 ～240 min呈下降的趋势，说明天麻对乳酸菌中氨基酸的利用有促进作用。添加天麻提取液中氨基酸含量在360 ～740 min 呈上升的趋势；CK 在240 ～740 min呈缓慢上升的趋势；同时添加天麻提取液中氨基酸的合成量远大于CK 中的合成量，表明天麻有促进乳酸菌代谢合成氨基酸的作用。另外，实验观测在40 ℃下，发酵740 min 以后，培养基中氨基酸的含量处于一个相对稳定的状况。

图4 不同发酵时间段中氨基酸的含量变化图

2.4 乳酸菌对培养液中氨基酸的利用量

2.4.1 氨基酸的降解量

以初始氨基酸的含量减去在最低点的氨基酸含量来表示乳酸菌对氨基酸的降解量，可知添加天麻的培养液对乳酸菌降解氨基酸的情况见表3。

表3 氨基酸降解量（mg/L）

从表3 中可以看出，添加天麻提取液的乳酸菌培养液中氨基酸的降解量为589.31 mg/L，对照组乳酸菌培养液中的氨基酸降解量为346.19 mg/L，可见在有天麻提取液的培养基中，乳酸菌对氨基酸的降解量高于对照243.12 mg/L，可见在乳酸菌发酵前期，天麻有促进乳酸菌降解氨基酸的作用。

2.4.2 降解量的方差分析

为了进一步分析添加天麻提取液和未添加天麻提取液中氨基酸降解量的差异显著性，采用SPSS软件对乳酸菌氨基酸的降解量进行方差分析，分析结果如表4所示。

表4 氨基酸降解量的方差分析

由表4 数据可知，经方差分析与显著性检验的F=173.778，查F 临界值表[22]，当a=0.05，df1=1，df2=10 时，F0.05（1,10）=4.96，F0.01（1,10）=10.04，则F＞F0.01。说明添加天麻，乳酸菌的氨基酸降解量与CK 具有极差异显著性。

2.5 乳酸菌合成氨基酸的量

2.5.1 氨基酸合成的量

在发酵液中，乳酸菌对氨基酸的降解量到达最低点后，随着乳酸菌的进一步生长代谢，乳酸菌开始合成氨基酸，氨基酸的含量在不断地增加，到达一定的时间后，氨基酸的含量不再变化，以从低点开始，氨基酸含量增大到不再变化时的氨基酸含量减去低点氨基酸的含量，即为乳酸菌合成氨基酸的量，结果见表5。

表5 氨基酸合成量

从表5 中可以看出，添加天麻的乳酸菌对氨基酸合成量的增加为407.33 mg/L，CK 的乳酸菌氨基酸合成量的增加为281.15 mg/L，可见在有天麻提取液的培养基中，乳酸菌对氨基酸的合成量高出对照126.18 mg/L，说明天麻有促进乳酸菌合成氨基酸的作用。

2.5.2 氨基酸合成量的比较分析

为进一步分析添加天麻提取液和未添加天麻提取液中氨基酸合成量的差异性，采用SPSS 软件对氨基酸合成量进行方差分析，结果如表6。

表6 氨基酸合成量方差分析

由表6 数据可知，经方差分析与显著性检验的F=84.67，查F 临界值表[22]，当a=0.05，df1=1，df2=10 时，F0.05（1,10）=4.96，F0.01（1,10）=10.04，则F＞F0.01。说明添加天麻，乳酸菌对氨基酸的合成量与CK 间具有极差异显著性。

3 讨论

牛乳中含有丰富的营养物质，但游离氨基酸的含量很低，为满足细胞（嗜热链球菌）生长的基本需求，保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌协同共生，共同满足2 种菌株生长所需营养物质的需求。嗜热链球菌为保加利亚乳杆菌提供甲酸、叶酸、丙酮酸和CO2，保加利亚乳杆菌产生的多肽类和氨基酸可以刺激嗜热链球菌的生长，提供二者所需的大部分氨基酸，但却不能完全满足含硫氨基酸和支链氨基酸生物合成的要求[15]。嗜热链球菌是营养缺陷型菌株，精氨酸和丙氨酸是嗜热链球菌生长的必需氨基酸。丝氨酸、组氨酸、亮氨酸、缬氨酸和色氨酸对嗜热链球菌的生长起着重耍作用，缺乏造成生长速率降低，产酸减少。赖氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和苏氨酸对嗜热链球菌的生长起着比较重要的作用，缺乏会使其生长变缓，产酸降低，对嗜热链球菌的生长作用重要性稍弱于前面所述的氨基酸[23]。天麻水提物中精氨酸的含量为0.88 mg/g，丙氨酸为1.85 mg/g，丝氨酸1.31 mg/g，组氨酸0.68 mg/g，亮氨酸0.59 mg/g，缬氨酸0.86 mg/g，赖氨酸0.66 mg/g，苯丙氨酸0.59 mg/g，酪氨酸0.23 mg/g 和苏氨酸0.69 mg/g[21]。可见在培养液中加入天麻提取液，可以满足嗜热链球菌对氨基酸的需求。

本实验采用茚三酮比色法测定乳酸菌发酵液中的氨基酸含量。添加天麻提取液的起始氨基酸含量为1 146.04 mg/L，CK 为609.80 mg/L，这是因为天麻中氨基酸的含量为2.730～2.927%[24]。添加天麻的乳酸菌在发酵到360 min 时，为最低点，含量为556.63 mg/L，CK 在240 min 时到达最低点，含量为264.03 mg/L；添加天麻对乳酸菌发酵液中氨基酸的降解量为589.31 mg/L，CK 的降解量为346.19 mg/L，高出CK 组243.12 mg/L，可见前期天麻有促进乳酸菌对氨基酸降解的作用。在后期（360 ～740 min），氨基酸的合成量在不断增加，直到740 min 之后，无显著增加，添加天麻的乳酸菌氨基酸合成量远远大于CK 氨基酸的合成量，高出CK 合成量126.18 mg/L，可见在后期天麻有促进氨基酸合成的作用。据叶红[25]等人研究报道可知，天麻中氨基酸种类含量较为丰富，主要有天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、脯氨酸等多种氨基酸；这些氨基酸（除脯氨酸和羟脯氨酸）与茚三酮发生反应，生成蓝紫色的化合物，所以选择570 nm 的波长测其吸光度。同时，这些氨基酸与茚三酮发生反应是在弱酸性条件下，茚三酮是一种强氧化剂，在弱酸性环境中与α-氨基酸共热，引起氧化脱氨反应，形成的产物还原型茚三酮能与另一个茚三酮分子和NH3缩合生成蓝紫色的化合物[26]。本实验配制pH5.6 的磷酸缓冲溶液，提供弱酸反应环境，使氨基酸能与茚三酮完全充分地进行显色反应，保证实验结果的准确性。据丁明洁[27]的仪器分析可知，吸光度在0.2 ～0.8 范围时，仪器的相对误差较小，调整待测溶液浓度，使其吸光度控制在0.2 ～0.8 的范围内，确保仪器测量的精密度和准确度。通过实验获知，天麻在前期有促进氨基酸降解的作用，后期有促进氨基酸合成的作用。但究竟是天麻中的单一物质起作用，还是多种物质共同起作用，这都将有待于进一步地实验探讨。