不同终末冲洗方案对牙髓再生过程中生长因子向根管间隙释放的影响

程 琳 徐茹霞 朱 琦

根管治疗虽可有效封闭根尖孔，一定程度恢复牙解剖形态和功能，但无法替代正常牙髓组织对牙滋养与修复作用，导致根管治疗后易出现牙体缺损和断裂[1]。当牙因龋病等因素出现脱矿时，转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）可从牙基质中大量释放，促进牙髓细胞向成牙本质细胞分化，介导牙体组织修复[2]。Galler 等[3]研究发现，根管消毒剂对牙本质TGF-β1 释放量存在影响。

资料和方法

收集2018 年7 月～2019 年12 月因正畸拔除的120 颗单根离体牙。纳入标准:①口腔锥形束CT显示为单根直根管；②牙根长13～15mm；③牙体完整且无龋坏、隐裂、填充物及修复体。排除标准:①既往根管治疗史；②牙根弯曲度＞20°；③处于哺乳期或妊娠期；④近3 个月使用抗生素、免疫调节剂治疗。70 例患者，男38 例，女32 例，年龄18～75 岁，平均年龄（49.42±11.25）岁。随机将牙样本分为阴性对照组（n＝20）、0.9%NaCl 组（n＝20）、17%乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid， EDTA）组（n＝20）、10%柠檬酸（Citric acid，CA）组（n＝20）、10%磷酸（phosphoric acid，PA）组（n＝20）和37%PA 组（n＝20）。

根段模型制备:磷酸盐缓冲生理盐水冲洗单根离体牙，刀片刮除牙面牙周组织，截除牙冠和根尖部分，取中段制备成高8mm，长6mm 圆柱形牙根段，外牙根表面涂抹指甲油。

TGF-β1 向根管间隙释放量:1.5%次氯酸钠（NaOCl）冲洗根段样品5min，30Ga 侧方开口冲洗针（瑞士康特齿科集团） 对预备完成根管进行终末冲洗，阴性对照组采用5mL 蒸馏水，0.9%NaCl 组采用5mL 的0.9%氯化钠溶液，17%EDTA 组采用5mL 的17%EDTA 溶液，10%CA 组采用5mL 的10%CA 溶液，10%PA 组采用5mL 的10%PA 溶液，37%PA 组采用5mL 的37%PA 溶液，操作流程按照厂家说明书进行；吸水纸纸尖干燥根段，置于含青霉素和链霉素各100U/mL 的α- 最低限度基本培养基（上海联硕生物科技有限公司，货号SH30265.01B），37℃培养24h；酶联免疫吸附测定培养基中TGF-β1 释放量（ 上海酶联生物科技有限公司， 货号ML-Elisa-0014）；最终吸收值与试剂盒提供标准值一致，每个样品重复测定三次取平均值。

残留冲洗剂细胞毒性[4]:水冷状态下，制备牙本质切片（5mm×5mm×1mm）；随机选取3 个未冲洗牙本质切片为对照组，剩余切片以1.5%NaOCl 冲洗5min 后，0.9%NaCl 组采用5mL 的0.9%氯化钠溶液，17%EDTA 组采用5mL 的17%EDTA 溶液，10%CA 组采用5mL 的10%CA 溶液，10%PA 组采用5mL 的10%PA 溶液，37%PA 组采用5mL 的37%PA溶液；吸水纸纸尖干燥牙本质切片表面，置于Transwell 上室；人根尖牙乳头干细胞置于无血清和生长因子培养基中培养，取5×104个细胞置于下室，中间以聚碳酸酯膜隔开，37℃24h；测定490nm波长处光密度值（optical density，OD），试剂盒购置于艾美捷科技有限公司，货号K300-500；细胞活力（%）＝（OD 实验组-OD 空白组）/（OD 对照组-OD空白组）×100%。

扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）检查:将试件安装在铝制短管上，金喷镀，台式扫描电子显微镜（×2500）观察根管表面及牙本质小管开口情况。

采用SPSS20.0 软件对数据进行统计分析。计量资料用（）表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较Snk-q 检验。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

结 果

终末冲洗24h 后，阴性对照组、0.9%NaCl 组和37%PA 组TGF-β1 释放量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；17%EDTA 组、10%CA 组、10%PA 组TGF-β1 释放量大于阴性对照组、0.9%NaCl 组和37%PA 组（P＜0.05）；10%CA 组TGF-β1 释放量大于17%EDTA 组和10%PA 组（P＜0.05），见表1。

0.9%NaCl、17%EDTA、10%CA、10%PA 和37%PA 冲洗根管后，SCAP 细胞活力与未处理的牙本质无显著差异（P＞0.05）；17%EDTA 组和10%CA 组SCAP 细胞活力高于37%PA 组（P＜0.05），图1。

表1 不同终末冲洗方案TGF-β1 向根管间隙释放量比较（pg/mL，）

表1 不同终末冲洗方案TGF-β1 向根管间隙释放量比较（pg/mL，）

与阴性对照组比较，aP＜0.05；与0.9%NaCl 组比较，bP＜0.05；与17%EDTA组比较，cP＜0.05；与10%CA 组比较，dP＜0.05；与10%PA 组比较，eP＜0.05

组别阴性对照组0.9%NaCl 组17%EDTA 组10%CA 组10%PA 组37%PA 组例数20 20 20 20 20 20 F P TGF-β1 42.13±12.58 45.36±13.42 246.37±18.47ab 512.34±20.25abc 225.15±18.64abcd 46.78±15.34cd 2461.748＜0.01

图1 不同残留冲洗液对SCAP 细胞的毒性作用（MTS 法）

图2 不同终末冲洗方案根管表面SEM 图像（×2500）

与0.9%NaCl 组比较，17%EDTA、10%CA、10%PA 和37%PA 冲洗后根管表面均存在少量玷污层。17%EDTA 组牙本质小管部分开口，有未完全去除的玷污层和堵塞物，而10%CA 组牙本质小管完全开放，无玷污层堵塞，图2。

讨 论

根管治疗可有效控制和消除感染，缓解根尖组织炎症反应，但治疗后患牙不具有免疫和形成继发性牙本质基质等功能，增加牙体断裂风险[5]。牙髓再血管化可在根管预备后，充分消毒根管，使坏死牙髓组织成为无菌基质，刺激根尖周组织出血，由血凝块提供干细胞、支架和生长因子，促进管腔内牙髓样组织形成和牙根再发育[6]。TGF-β1 在促进牙髓干细胞增殖和体外成牙本质分化中起着重要作用[7]。有文献报道，EDTA 预处理前用氯己定灌水可增加TGF-β1 释放[3]。抗菌剂、脱钙剂、组合成分、天然药物为常用根管冲洗液。NaOCl 具有高效杀菌和溶解有机组织作用，1%NaOCl 可有效减少根管内粪肠球菌感染，但其在溶解牙髓软组织的同时，可破坏根管壁牙本质基质[8]。EDTA 可与羟磷灰石中Ca2+结合形成络合物，溶解无机成分。研究证实，EDTA 可有效提取牙本质基质中TGF-β1[9]。另有研究发现，NaOCl+17%EDTA 冲洗组合可有效去除根管玷污层，开放牙本质小管，阻止微生物再定植[10]。柠檬酸（citric acid，CA）可与Ca2+螯合形成可溶性络合物，有效去除根管壁有机玷污层[11]。研究表明，同一温度下，NaOCl+MTAD 清除根管玷污层能力优于NaOCl+EDTA[12]。Prado M 等[13]研究发现，37%PA 抗菌活性与2%氯已定和5.25% NaOCl 相似，但细胞毒性高于17% EDTA 和10% CA。

本研究中，TGF-β1 释放量上，10% PA、10%CA 和17% EDTA 强于其他终末冲洗方案，其中10% CA 方案显示出更大优势，提示10% CA 在促进牙本质基质释放TGF-β1 效果上优于其他冲洗方案，结果中10%CA 表现出较突出的促TGF-β1释放作用与Galler 等[3]研究结果不一致，原因可能为牙本质片取材部位和TGF-β1 收集方法不同。与未处理牙本质比较，不同冲洗液冲洗根管后，SCAP 细胞活力无显著差异，提示本研究中的终末冲洗液均未对SCAP 细胞产生明显毒性作用。与37% PA 比较，17% EDTA 和10% CA 表现出更小细胞毒性，与Prado 等[13]研究结果一致。根管壁玷污层可抑制牙髓干细胞植入粘附，阻止生长因子释放，降低再生牙髓治疗成功率[14]。本研究发现，与0.9% NaCl 组比较，17% EDTA、10% CA、10% PA 和37% PA 冲洗后根管表面存在少量玷污层，但10% CA 去污效果可能优于17% EDTA。