复方五藤散的质量标准研究

屈相玲 韩云霞 熊成欢 晏英 代欣 高永跃 周训蓉△

(1.贵州中医药大学第二附属医院，贵州 贵阳 550003；2. 医院制剂研发中心，贵州 贵阳 550003；3. 医院中药制剂研究中心，贵州 贵阳 550003； 4. 贵州医科大学，贵州 贵阳 550004)

复方五藤散是由大血藤、鸡血藤、首乌藤、雷公藤、黑骨藤、麻黄、千里光、皂角刺、红花等22味中药研磨混合制成的散剂,具有通络、止痛祛风湿之功效，临床用于治疗风湿性关节炎、骨性关节炎、痛风性关节炎等[1]。为了在临床基础上对制剂质量进行控制，本研究建立复方五藤散质量标准，采用薄层色谱法(TLC)对制剂中大血藤、鸡血藤、首乌藤进行定性鉴别，采用HPLC同时测定制剂中雷公藤甲素、杠柳毒苷的含量，为提高复方五藤散整体质量控制方法提供实验依据。

1 材料与方法

1.1实验试剂及仪器 大血藤对照药材(批号：121353～201704)、鸡血藤对照药材(批号：121173～201805)、首乌藤对照药材(批号：120939～201507)、雷公藤甲素对照品 (20 mg，批号111567～201404)、杠柳毒苷对照品(20 mg，批号111793～200901)均购于中国食品药品检定研究院，硅胶G 薄层板(青岛海洋化工厂)；乙腈、磷酸(色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司)，水(纯净水，杭州娃哈哈集团)。2010 型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；BSA124S电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)，SG8200HE超声波清洗器(上海冠特超声仪器有限公司)，SHB-Ⅲ循环水式真空泵(郑州长城科工有限责任公司)， FA180S十万分之一天平(上海精密仪器仪表有限公司)。

1.2试药 复方五藤散样品由贵州中医药大学第二附属医院制备(批号：20181220、20181221、20181222)，处方饮片(贵州同济堂中药饮片有限公司提供)，阴性样品自制。

1.3薄层色谱定性鉴别方法

1.3.1大血藤的薄层鉴别[2-3]取复方五藤散5 g，加甲醇50 mL超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加2 % 氢氧化钠溶液10 mL使溶解，用盐酸调节pH值至2，用乙醚振摇提取3次，10 mL/次，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。另取大血藤对照药材2 g，缺大血藤阴性制剂同法制备，作为对照药材溶液和阴性对照溶液。照《中国药典》2015年版四部薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述两种溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷—丙酮—甲酸(40∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，立即喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。

1.3.2鸡血藤的薄层鉴别[4]取复方五藤散2 g，加乙醇40 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水10 mL使溶解，用乙酸乙酯10 mL振摇提取，乙酸乙酯液挥干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取鸡血藤对照药材2 g，缺鸡血藤阴性制剂同法制备，作为对照药材溶液和阴性对照溶液。吸取上述溶液5～10 μL、分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷—甲醇—甲酸(40∶10∶1)为展开剂，其余操作同“1.3.1”。

1.3.3首乌藤的薄层鉴别 取复方五藤散0.25 g，加乙醇50 mL，加热回流1 h，滤过，滤液浓缩至1 mL，作为供试品溶液。另取首乌藤对照药材2 g，缺首乌藤阴性制剂同法制备，作为对照药材溶液和阴性对照溶液。吸取上述溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(30～60℃)—乙酸乙酯—甲酸(18∶6∶1)的上层溶液为展开剂[5]，其余操作同“1.3.1”。

1.4含量测定 HPLC 同时测定雷公藤甲素、杠柳毒苷的含量。色谱条件[6-9]：色谱柱 Welch Ultimate X8-C18(250×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.05%磷酸溶液(B)，梯度洗脱，0～20 min，20%A，20～40 min，20%→80%A；40～45 min，80%→100%A；45～50 min，100%→20%A；检测波长：210 nm；流速：0.8 mL/min；进样量：10 μL。对照品储备液的制备：称取雷公藤甲素对照品2.8 mg、杠柳毒苷对照品3.4 mg，分别置50 mL容量瓶中，加甲醇超声溶解并至刻度，摇匀，配成0.056 mg/mL的雷公藤甲素储备液，0.068 mg/mL的杠柳毒苷储备液。供试品溶液的制备：取复方五藤散14.5 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入70%甲醇加热回流3次后定容至1 000 mL，滤过，取续滤液，即得。阴性对照溶液的制备:按处方取除雷公藤及黑骨藤的各味药材，按处方量配制雷公藤和黑骨藤阴性制剂，按“供试品溶液的制备”方法分别制得雷公藤和黑骨藤阴性对照溶液。分别对复方五藤散含量测定方法的系统适用性、线性关系、精密度、重复性、稳定性、加样回收率试验、样品含量测定进行分析，以验证分析方法的可靠性。

2 结 果

2.1薄层色谱方法考察 大血藤在供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显同颜色的斑点，且阴性供试品溶液无干扰。鸡血藤在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，且阴性供试品溶液无干扰。首乌藤在与对照药材色谱相应的位置上，显同颜色的斑点，且阴性供试品溶液无干扰。见图1。

注：1.大血藤对照药材；2、3、4.三批次五藤散制剂样品(批号：20181220、20181221、20181222)；5.缺大血藤制剂样品；6.鸡血藤对照药材;7、8、9.三批次五藤散制剂样品(批号：20181220、20181221、20181222);10.缺鸡血藤制剂样品；11.首乌藤对照药材;12、13、14.三批次五藤散制剂样品(批号：20181220、20181221、20181222)；15.缺首乌藤制剂样品。图1 薄层色谱图

2.2含量测定方法考察

2.2.1系统适用性试验 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照品溶液各10 μL，按“2.1”项下色谱条件测定，供试品溶液中2种成分分离较好，且阴性对照溶液无干扰。见图2。

注：A.混合对照品溶液；B.供试品溶液；C.雷公藤和黑骨藤阴性供试品溶液；1.雷公藤甲素；2.杠柳毒苷。图2 复方五藤散HPLC色谱图

2.2.2线性关系考察 分别精密量取雷公藤甲素储备液0.3、0.5、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，杠柳毒苷储备液3、5、8、10、12、14 mL分别置20 mL容量瓶中，加甲醇超声溶解并至刻度，摇匀，制得系列质量浓度的标准溶液。精密吸取上述混合对照品各10 μL，按色谱条件测定峰面积，以对照品浓度为横坐标(X)，峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归，回归方程分别为：Y雷公藤甲素=215 431 6X+394 70，R2=1；Y杠柳毒苷=149 367 5X+ 808 50，R2=0.999 6，结果表明，雷公藤甲素和杠柳毒苷在0.000 84～0.003 92 μg和 0.010 2～0.047 6 μg，范围内与峰面积线性关系良好。

2.2.3仪器精密度试验 精密量取同一对照品溶液连续进样6次，以峰面积计算雷公藤甲素、杠柳毒苷RSD值为0.12%和0.19%，仪器精密度良好。

2.2.4重复性试验 取同一批供试品，按供试品制备方法制备供试品溶液，在色谱条件下进样分析。计算雷公藤甲素和杠柳毒苷含量的RSD值分别为2.04%和2.24%，表明方法重复性良好。

2.2.5稳定性试验 取室温下放置的同一份供试品溶液分别于0、2、4、6、8和12 h 进样分析，计算雷公藤甲素和杠柳毒苷峰面积的RSD值分别为1.05%和1.44%，表明供试品溶液在12 h 内稳定。

2.2.6加样回收率试验 取已知含量的样品(批号：20181220)，分别精密加入雷公藤甲素和杠柳毒苷对照品溶液，按供试品制备方法制备供试品溶液，在色谱条件下测定，计算回收率。结果雷公藤甲素平均回收率为100.2%，RSD=0.64%；杠柳毒苷平均回收率为100.63%，RSD=2.04%。 见表1。

表1 两种化合物的加样回收率结果(n=6)

2.2.7样品含量测定 取3个不同批次的样品(批号：20181220、20181221、20181222)，按供试品制备方法方法制备供试品溶液，在色谱条件测定峰面积计算样品含量，雷公藤甲素和杠柳毒苷的平均含量分别为0.011 3 mg/g和0.18 mg/g。

3 讨 论

血藤清热解毒、活血祛风、止痛；鸡血藤祛风活血、舒筋活络；首乌藤养血安神、祛风通络；雷公藤祛风除湿、活血通络、消肿止痛；黑骨藤活血通经，祛风除湿；五者合为君药，其中雷公藤甲素为雷公藤的指标成分[10]，杠柳毒苷为黑骨藤的指标成分[11]。本实验按照《中国药典》(2015 年版一部)对大血藤、鸡血藤、首乌藤进行定性分析。在雷公藤甲素和杠柳毒苷的同时测定中，选择了热回流提取2 h。本实验结果表明，热回流提取2 h效果最好。建立HPLC 同时测定雷公藤甲素和杠柳毒苷的含量，考察210 nm 及230 nm 下出峰情况，在两种检测波长下2个色谱峰均达到较好分离，相比230 nm，210 nm 处检测到的雷公藤甲素和杠柳毒苷峰面积值增大，因此本研究建立含量测定方法检测波长定为210 nm。