CD8+T细胞在不同年龄家兔胃肠道的分布规律

谢 飞，李淑娴，火兴民，刘丽萍，李 瑞，张学锋，王雯慧

(甘肃农业大学 动物医学院，甘肃 兰州 730070)

T淋巴细胞简称为T细胞，是一类重要的免疫调节细胞，可分为αβT细胞和γδT细胞2类[1]。其中，αβT细胞是参与介导和调节细胞免疫应答的重要组成成分，也是机体内数量最多的T细胞亚群。跟据表面标志物的不同，可将其进一步分成CD4+T细胞和CD8+T细胞2种，虽然两者都起源于胸腺前体细胞，但所发挥的生物学效应有着明显的区别[2]。CD8+T细胞作为αβT细胞的一种，在机体内主要发挥消除肿瘤细胞和坏死组织的作用，是保护和维持机体细胞健康的“卫士”。其活化受到双重信号的介导，第1个信号是由TCR与pMHCⅠ类复合体相互识别后产生的，第2个信号则主要来源于其所作用的靶细胞。因此，靶细胞即是CD8+T细胞所针对的对象，也是使其开始增殖和分化的动力。当靶细胞受到外界感染而失去信号传导的功能时，CD8+T细胞也就不能被活化，甚至还能引起疾病的发生。

家兔是我国养殖业中重要的经济动物，也是实验室经常使用的试验动物，在我国经济和科学研究领域具有不可替代的作用[3-5]。本试验选取不同年龄家兔作为实验动物，研究和描述其不同年龄、不同胃肠部位CD8+T细胞的分布规律，旨在为进一步探讨家兔胃肠道黏膜免疫提供一些资料，同时也为本课题组的相关研究提供比较性资料。

1 材料与方法

1.1 实验动物30只日本大耳白兔按照幼年组(2月龄)、青年组(6月龄)、老年组(36月龄)3个年龄段分为3组，每组10只，雌雄各半。

1.2 样品的采集采用耳缘静脉注射戊巴比妥钠的方法处死，迅速剖检取其胃(胃底腺区、幽门腺区)、小肠(十二指肠、空肠、回肠)和大肠(盲肠、结肠、直肠 )不同部位组织，放入10%中性甲醛溶液中；按常规制作石蜡切片，进行免疫组化染色。

1.3 免疫组织化学染色采用SABC免疫组织化学的染色方法，依次将切片放入二甲苯、苯酒精、100%酒精、95%酒精和80%酒精中，再经H2O2灭活、抗原修复、BSA封闭、一抗(羊抗鼠CD8多克隆抗体，购于SANTA CRUZ)和二抗孵育(生物素化的驴抗羊IgG，购于博奥森)、DAB显色、复染、脱水和透明等过程，最后封片并进行显微镜观察、照相。

1.4 统计方法用OlympusDP-71显微镜观察组织切片并拍照。每个年龄段从胃到直肠各个部位的组织样品随机取5张切片，每张切片随机选10个视野，统计单位面积内阳性细胞的数量。采用SPSS 17.0进行统计，差异显著性检验采用独立样本t检验，P<0.05判断为有显著性差异。

2 结果

2.1 CD8+T细胞在胃中分布的特征

2.1.1CD8+T细胞在胃中分布的位置 呈色反应阳性的CD8+T细胞为棕黄色，呈圆形或不规则形，主要位于胃的固有层中并沿黏膜肌层进行分布。有时在固有层的胃腺间也可见到散在的CD8+T细胞，但数量较少(图1)。

A．CD8+T细胞在胃底腺区的分布情况(40×)；C.CD8+T细胞在幽门腺区的分布情况(40×);B,D.分别为A、C的局部放大(100×)。黑色箭头.阳性细胞。下同

2.1.2CD8+T细胞在胃中分布的数量变化 统计结果显示，CD8+T细胞在幽门腺区和胃底腺区处分布的数量无显著性差异(P>0.05)，但在不同年龄组中，青年组CD8+T细胞的分布数量要显著高于幼年组和老年组(P<0.05),而幼年组和老年组之间CD8+T细胞的数量差异并不显著(P>0.05)(表1,图2)。

表1 不同年龄组家兔胃中CD8+T细胞分布的数量差异

图2 不同年龄组家兔胃中CD8+T细胞分布的数量变化趋势

2.2 CD8+T细胞在小肠中分布的特征

2.2.1CD8+T细胞在小肠中分布的位置 CD8+T细胞为棕黄色，呈圆形或椭圆形，主要分布于小肠各段的固有层和隐窝处，其余部位未见有CD8+T细胞的存在(图3～5)。

A.CD8+T细胞在十二指肠肠绒毛不同区域内的分布情况(40×);B,C.分别为a、b的局部放大(100×);D，E.为阴性对照(100×)

A.CD8+T细胞在空肠肠绒毛不同区域内的分布情况(40×)；B,C.分别为a、b的局部放大(100×)；D，E.阴性对照(100×)

A.CD8+T细胞在回肠肠绒毛不同区域内的分布情况(40×);B,C.分别为a、b的局部放大(100×)；D,E.阴性对照(100×)

2.2.2CD8+T细胞在小肠中分布的数量变化 统计结果显示，相同年龄组内，小肠CD8+T细胞分布的数量差异并不显著(P>0.05)；不同年龄组间，青年组各肠段内CD8+T细胞的分布数量显著高于幼年组和老年组，并具有统计学意义(P<0.05)；而幼年组和老年组之间的差异并不显著(P>0.05)(表2，图6)。

表2 不同年龄组家兔小肠各段CD8+T细胞分布的数量差异

2.3 CD8+T细胞在大肠中分布特征

2.3.1CD8+T细胞在大肠中分布位置 CD8+T细胞为棕黄色，呈圆形或椭圆形，主要分布在盲肠、结肠以及直肠的固有层和隐窝处，在黏膜下层、肌层以及浆膜层均未见有阳性细胞的分布(图7，8，9)。

2.3.2CD8+T细胞在大肠中分布的数量变化 统计结果显示，相同年龄组内，CD8+T细胞在盲肠、结肠以及直肠的数量差异并不显著(P>0.05)；青年组CD8+T细胞的数量显著高于老年组和幼年组，并具有统计学意义(P<0.05)；老年组和幼年组之间CD8+T的数量差异并不显著(P>0.05)(表3,图10)。

图6 不同年龄组家兔小肠各段CD8+T细胞分布的数量变化趋势

A.阳性细胞(40×);B.a的局部放大(100×);C.阴性对照(100×)

A.阳性细胞(100×);B.阴性对照(100×);黑色箭头所示为阳性细胞

A.阳性细胞(40×);B.A的局部放大(100×);黑色箭头所示为阳性细胞

表3 不同年龄组家兔大肠各段CD8+T细胞分布的数量差异

图10 不同年龄组家兔大肠各段CD8+ T细胞分布的数量变化趋势

3 讨论

胃肠道不仅是体内最大的消化器官，同时也是外界病原侵袭和感染的主要部位[6]。有资料表明[7-8]，每8～10个肠上皮细胞之间就有一个上皮内淋巴细胞(IEL)的存在，主要由CD8+T细胞组成，起局部黏膜免疫的作用。因此，CD8+T细胞是小肠上皮内数量最多的T细胞亚群，也是肠相关淋巴组织的重要组成成分，在机体抵御外界病原菌感染的过程中发挥着重要的作用。

虽然家兔是一种常见的实验动物，但对其胃肠道CD8+T细胞分布的特征却知之甚少[9-10]。本试验通过对不同年龄组家兔胃肠道CD8+T细胞进行定位和统计学分析，得出以下结论：从家兔年龄来看，相同年龄组家兔之间CD8+T细胞的数量差异并不显著(P>0.05)，而不同年龄组家兔之间,青年组CD8+T细胞的数量显著高于老年组和幼年组，并具有统计学意义(P<0.05)。老年组CD8+T细胞的数量和幼年组相比差异并不显著(P>0.05)，表明CD8+T细胞的数量随着年龄的变化呈现先上升后下降的趋势性变化。这与吴永坚[11]和李铭德[12]的研究结果相符，说明CD8+T细胞在人和家兔胃肠道内的数量随着年龄的变化有相同的趋势，都随着年龄的增长呈现先上升后下降的趋势性变化。导致这种趋势性变化的原因有很多，但胸腺的发育及退化可能是其最为重要的原因之一。这不仅拓展了CD8+T细胞在胃肠道分布的理论基础，也为进一步研究胃肠道相关性疾病提供了科学依据[13]。从分布的位置来看，本试验CD8+T细胞在胃底腺区和幽门腺区分布的位置完全相同，都位于固有层中。而小肠和大肠中CD8+T细胞的分布位置相同，都分布于肠道各段的固有层中，在隐窝处也有散在分布。这与莫修建等[14]的研究结果比较符合，说明肠道上皮和固有层是CD8+T细胞的主要定植部位，也是其发挥功能的主要场所。从分布的数量来看，CD8+T细胞在各肠段之间分布的数量无明显的差异，但在小肠与大肠内分布的数量具有统计学意义(P<0.05)，其分布的总量按照小肠、大肠、胃的顺序依次递减。但张永东等[15]在其研究结果中发现CD8+IEL的分布数量沿肠道依次递减,而CD8+LPL的分布数量则沿肠道依次递增。综合分析，可以做出以下推断：CD8+T细胞在胃肠道内分布的总量和CD8+IEL分布的趋势变化一致，都沿肠道依次递减，而CD8+LPL的分布数量则沿肠道依次递增。引起这种趋势性变化的原因很有可能与肠道不同部位的功能有关。小肠是机体内进行物质交换的主要场所，也是最易受到病原感染的部位，对整个机体的健康具有十分重要的意义。因此，CD8+T细胞选择性的大量定植于此，确保了肠道的完整和健康，从而为整个机体的健康保驾护航。同时，IEL作为肠道上皮内重要的免疫细胞之一，是离外界病原菌最近的部位，同时也是肠道免疫应答中的第一梯队，因此，CD8+T细胞在IEL内聚集，可以在最短的时间内与病原菌结合并发挥生物学效应，体现了机体免疫调节的精密性和可操作性。而CD8+LPL的分布趋势原因亦是如此[16]。