非洲猪瘟病毒锁核酸探针荧光定量PCR检测方法的建立

李 艳，郭怡德，勾红潮，卞志标，孙铭飞，蔡汝健，宋 帅，蒋智勇，楚品品，徐民生，杨东霞，李春玲*

(1.广东省农业科学院 动物卫生研究所，广东 广州 510640；2.广东省畜禽疫病防治研究重点实验室，广东 广州 510640；3.农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站，广东 广州 510640)

1 材料与方法

1.1 供试病毒株ASFV SY18毒株、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)均由广东省畜禽疫病防治研究重点实验室保存。

1.2 主要试剂和仪器克隆载体pMD19-T vector、Ex Taq以及Premix Ex Taq(Probe qPCR)购自TaKaRa公司，其他试剂均购自国内生化试剂厂商。主要仪器有荧光定量PCR仪(LightCycler96)和紫外分光光度计(BioTek)。

1.3 引物和探针设计参考ASFV SY18毒株(MH713612)P72基因核苷酸序列设计特异性引物(P1、P2)和探针，用作实时荧光定量PCR的引物和探针，序列见表1。

表1 特异性引物和探针信息

1.4 标准质粒样品的制备含有ASFV SY18毒株P72基因序列的质粒标准品pMD19-T-ASFV-P72由本实验室构建，其中P72基因片段由生工生物(上海)工程股份有限公司合成。阳性质粒用紫外分光光度计测浓度和纯度，D260值定量浓度，并转换成拷贝数：拷贝数=浓度×阿伏伽德罗常数/(1个碱基对的平均相对分子质量×总长度)，阿伏伽德罗常数为6.02×1023。已知拷贝数的重组质粒10倍梯度稀释后作为标准品，-20℃保存备用。

1.5 实时荧光定量PCR反应体系及条件优化采用20 μL反应体系，退火温度设置为58.0，58.5，59.0，59.5，60.0，60.5，61.0，61.5℃ 等8个温度梯度。反应体系：2×Premix Ex Tag 10 μL，P1 0.6 μL(0.3 μmol/L)，P2 0.6 μL(0.3 μmol/L)，探针0.3 μL(0.15 μmol/L)，DNA模板1 μL，用ddH2O补充至20 μL。引物浓度200，300，400，500，600 nmol/L，探针浓度50，100，150，200，250 nmol/L，分别稀释5个浓度梯度。选取最低的Ct值。循环条件：预变性95℃10 min；95℃15 s，60℃ 30 s，扩增45个循环。

1.6 实时荧光定量PCR标准曲线的建立将阳性重组质粒pMD19-T-ASFV-P72进行10倍梯度稀释，得到3.9×100～3.9×109拷贝/μL 10个稀释度的重组质粒作为标准品模板，按照1.5优化的反应条件进行荧光定量PCR，得出各自的扩增曲线，并绘制标准曲线。

1.7 特异性试验分别提取CSFV、PRRSV、PCV2的核酸，采用1.5优化的荧光定量PCR检测方法的反应体系，以pMD19-T-ASFV-P72重组质粒作为标准阳性对照，CSFV、PRRSV、PCV2基因组DNA作为其他毒株模板，无菌水作为阴性对照，进行扩增，验证所建立方法的特异性。

1.8 敏感性试验以重组质粒pMD19-T-ASFV-P72为标准阳性质粒，分别进行10倍倍比稀释，每个模板浓度设3个平行，以此为模板进行LNA-TaqMan探针和常规TaqMan探针荧光定量PCR扩增，通过观察扩增曲线确定检测到重组质粒的最低拷贝数，建立标准曲线，评估并比较LNA-TaqMan探针和常规TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的敏感性。

在进行分区管理时一般将区域划分为3级。1级分区主要是依据行政管理进行划区；2级分区主要是1级分区中漏损严重区域，包括供水只限、用水大户等；3级分区一般为层叠式的，为上层分区中流入的。在DMA分区中要考虑的因素众多，如自然边界、地形差异、调度运行、压力管理、管网现状和用户结构等[4]。DMA分区计量管理的内容主要包括：DMA边界确定、管网水力模型建立、管网信息调研、用水用户调查、规划分析语DMA边界确定、压力控制和优化调度分析等。DMA检测漏损的具体技术流程如图2所示。

1.9 重复性试验选取不同浓度pMD19-T-ASFV-P72重组质粒为模板进行LNA-TaqMan探针荧光定量PCR检测，每个浓度设置3个重复孔，同样的反应条件分别进行3次试验，计算方法的变异系数，评估方法的重复性。

1.10 样品的检测用已建立的LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法对56份临床样品进行检测，并与OIE提供的qPCR方法进行比对。

2 结果

2.1 实时荧光定量PCR标准曲线的绘制将ASFV阳性重组质粒pMD19-T-ASFV-P72 10倍梯度稀释为3.9×100～3.9×109拷贝/μL共10个稀释度，进行LNA-TaqMan探针荧光定量PCR和常规TaqMan探针荧光定量PCR，获得阳性重组质粒pMD19-T-ASFV-P72的标准扩增曲线(图1)。LNA-TaqMan探针法标准曲线的浓度为3.9×100～3.9×109拷贝/μL具有很好的相关性，线性方程式y=-2.948 1x+40.651 0，R2=0.991 3；而TaqMan探针法标准曲线的浓度为3.9×101～3.9×109拷贝/μL也具有很好的相关性，线性方程式y=-3.084 3x+42.572 0，R2=0.995 7(图2)。

A．LNA-TaqMan探针法标准曲线；B.TaqMan探针法标准曲线。1～10.依次为3.9×109，3.9×108，3.9×107，3.9×106，3.9×105，3.9×104，3.9×103，3.9×102，3.9×101，3.9×100拷贝/μL

2.2 LNA-TaqMan探针荧光定量PCR检测系统的优化与建立

2.2.1LNA-TaqMan探针荧光定量PCR退火温度的优化 选取58.0，58.5,59.0,59.5,60.0,60.5,61.0,61.5℃ 8个不同的退火温度进行LNA-TaqMan探针荧光定量PCR扩增，通过对不同退火温度扩增曲线的Ct值进行比较，结果显示59.0℃时的Ct值为17.26，是8个退火温度中的最小值，因此退火温度为58.0℃时pMD19-T-ASFV-P72重组质粒的扩增效率最高。

2.2.2LNA-TaqMan探针荧光定量PCR引物浓度优化 通过对200,300,400,500,600 nmol/L 5个不同浓度的上、下游引物进行扩增，得到的扩增曲线显示，在上、下游引物浓度为300 nmol/L时，pM-D19-T-ASFV-P72重组质粒的Ct值最低,因此，上、下游引物的最佳浓度确定为300 nmol/L(图3)。

A.LNA-TaqMan探针法标准曲线；B.TaqMan探针法标准曲线

2.2.3LNA-TaqMan探针荧光定量PCR探针浓度优化 探针按照50，100，150，200，250 nmol/L稀释5个浓度梯度,进行LNA-TaqMan探针荧光定量PCR扩增，得到扩增曲线按照最低Ct值确定，LNA-TaqMan探针荧光定量PCR的最佳探针浓度为150 nmol/L(图4)。

图3 ASFV LNA-TaqMan探针荧光定量PCR引物浓度的优化

2.2.4LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法的灵敏性检测 pMD19-T-ASFV-P72重组质粒10倍倍比稀释后，按照优化后的反应体系和反应条件进行灵敏度检测。检测结果显示，P72基因LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法的检测浓度下限是3.9拷贝/μL，而常规TaqMan探针荧光定量PCR方法的检测浓度下限是39.0拷贝/μL。

图4 ASFV LNA-TaqMan探针荧光定量PCR探针浓度的优化

2.2.5LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法的特异性检测 对CSFV、PRRSV、PCV2的基因组核酸以及pMD19-T-ASFV-P72阳性重组质粒同时进行检测，结果显示，只有pMD19-T-ASFV-P72阳性重组质粒可产生特异性扩增曲线，其余皆为阴性(图5)，证明该方法的特异性良好，可以用于ASFV的检测。

1.pMD19-T-ASFV-P72阳性重组质粒(3.9×106拷贝/μL)；2.CSFV；3.PRRSV；4.PCV2；5.阴性对照

2.2.6LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法的重复性检测 以pMD19-T-ASFV-P72质粒标准品中的3.9×106，3.9×105，3.9×103拷贝/μL等3个浓度的DNA作为模板，每个浓度重复3次，按照优化的扩增体系和条件进行实时荧光定量PCR。结果如表2所示，变异系数小于1%，说明所建立的LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法重复性较好，结果稳定可靠。

表2 LNA-TaqMan探针荧光定量PCR重复性试验

2.2.7LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法的应用 应用所建立的检测方法对临床样品进行检测，同时用OIE推荐的实时荧光PCR方法进行检测[12]。结果显示，56份样品均无扩增曲线出现，检测结果均为阴性，与OIE推荐的实时荧光PCR法检测结果一致。

3 讨论

ASFV作为一种烈性病原体，早期临床诊断尤为重要。实时荧光定量PCR技术作为早期核酸诊断方法优势明显，是目前病原早期诊断的首选检测方法，在ASFV疫病流行和诊断中亦发挥重要作用，可对血液、粪便、分泌物、猪肉制品等多种样品中的ASFV进行核酸检测。但常规荧光定量PCR技术的检测灵敏度仍有待进一步提高，通过对探针进行修饰可有效提高实时荧光定量PCR检测方法的敏感性和特异性。目前，常用的修饰探针包含MGB探针、TaqMan探针、Scorpion探针、LNA探针等，LNA探针是4种不同探针(MGB探针、TaqMan探针、Scorpion探针、LNA探针)中敏感性最强的探针[14]。

LNA碳环的2′O位和4′-C位通过缩水作用形成亚甲基桥并连接成锁状结构，增加了磷酸盐骨架的稳定性，使PCR反应中其与DNA、RNA结合成的双链的稳定性和亲和力更高[21-22]。解链温度相同时，LNA-TaqMan探针比常规TaqMan探针更短，更短的探针，扩增干扰更少，PCR扩增效率更高，敏感性更强[23]。前期我们基于LNA探针技术建立了猪伪狂犬病病毒的LNA探针荧光定量PCR方法，方法的特异性和敏感性均较好[20]。

目前，国内尚未见LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法检测ASFV的研究报道，基于LNA-TaqMan探针的灵敏度及特异性等优势，本试验将LNA探针技术应用于目前肆虐养猪业的ASFV的检测，通过优化方法的引物浓度、探针浓度及退火温度，成功建立了基于P72蛋白基因的ASFV的LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法，结果显示该方法的检测下限为3.9拷贝/μL的pMD19-T-ASFV-P72重组质粒，而常规TaqMan探针法的检测灵敏度为39.0拷贝/μL，LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法的灵敏度较常规TaqMan探针法提高了10倍，敏感性更强。本试验同时对建立的LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法的特异性进行了检测，结果所建立方法对CSFV、PRRSV和PCV2的基因组核酸都不能产生特异性信号，特异性很好。

本试验建立了基于ASFV P72基因的LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法，方法的灵敏度高，特异性强，可用于ASFV临床诊断，对于开展ASFV的流行病学研究及防控工作具有重要意义，同时为ASFV诊断提供了一种新的技术选择。