滴度及注射方式对2型腺相关病毒载体表达效果的影响

贾俊涛，王 昆，潘 登，李 强，杜晨光,*

(1．内蒙古农业大学 职业技术学院,内蒙古 包头014109；2.河北省农林科学院 粮油作物研究所，河北 石家庄 050000;3.内蒙古农业大学 兽医学院，内蒙古 呼和浩特 010018)

对有关发育、学习、行为和能量调控等相关神经网络的探索是生命科学的研究热点之一，其相关问题可以通过对某个特定神经元或核团的人为干扰或研究某一分子在神经回路中的影响来得到一定的解答。高度特异性和高效的方法是支撑这些研究成功的基础。腺病毒家族由不具有包膜的30～38 kb线性DNA组成[1]。根据其凝集特点可以将57个血清型分为A～G类[2]。由不同的血清型衍生而来的各种腺相关病毒载体(adeno-associated viral vector,AAV) 是一种可用于靶向和操纵神经系统内特定神经元亚型的强力工具[3]。在使用这种工具之前，有些问题应当重视，其包括但不仅限于：(1)如何运送AAV至指定区域；(2)使用何种基因调控元件；(3)选择何种血清型[4]。研究表明，脑立体定位注射是运送AAV至指定神经元或核团的常用方式[5]；突触启动子(synapsin promoter)等强力启动子则是增强AAV在中枢神经系统中转导性的必备元件之一[6]；2型腺相关病毒载体(adeno-associated viral vector serotype 2,AAV2)因其神经元特异性，长期以来被用于神经系统的相关研究当中[7]。因此，在神经学研究中，选择具有较强启动子的AAV2运载外源基因、通过脑立体定位注射到指定核团则有利于试验的顺利进行。本试验选择AAV2-CMV-EGFP对照载体进行研究正是基于以上原因。

通过对外源的转录、翻译，AAV可将特异神经元跨突触信号传递情况直观反映出来[8]。这样的试验结果大大方便了人们对不同神经核团之间信号传导的研究(包括不同脑半球之间的信号沟通)，但也体现出另外一个问题：即如何保证外源基因随载体进入目标神经元后的表达周期内，病毒不会因扩散至相邻的神经核团带来试验数据的干扰？为了验证这种情况是否存在，我们在考虑参考文献[4]提出的3个基本问题的基础上，利用对照试验中常用的AAV2-CMV- EGFP(1.3×1011mg/L)对3周内病毒的扩散区域进行了检测；同时，验证了不同滴度和注射方式下，AAV能否在注射区域附近局限性表达，期望可以为AAV相关技术在兽医研究应用中的普及提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物饲养试验使用的小鼠为C57BL/6雄性小鼠(6周,20～23 g)，购自北京维通利华公司。小鼠饲养在12/12 h周期的环境下(光照时间为07：00至19：00)。按照《内蒙古大学实验动物使用和护理指南》的道德标准进行试验(批准号SYCK2014-002)。脑立体定位前2 h，移除小鼠的水和食物。

1.2 腺相关病毒载体脑立体定位注射选择Dil Stain (D3911,ThermoFisher)用于确定注射位点。使用1%～3%异氟烷进行诱导麻醉，0.3%异氟烷用于呼吸麻醉的维持。呼吸后固定于全自动脑立体定位仪(Neurostar,StereoDrive-DM)，根据图谱所示位置进行定位(stereotaxic coordinates of the mouse hypothalamus[9])。相应位置打孔后，利用微量注射器将AAV2-CMV-EGFP(HAV1001,汉恒生物)注射于RPa (from Lambda:anterior-posterior (AP):-2.2 mm,mediolateral(ML):+0.0 mm,dorsoventral(DV):-5.5 mm,图1)、延髓中部(from Lambda:AP:-2.2 mm,ML:+0.0 mm,DV:-3.0 mm,图2)。普通注射:0.25 μL/min注射4 min，停针2 min；压力注射:以0.1 μL/min，注射10 min，停针10 min。无菌条件缝合伤口皮肤，术后注射40万单位青霉素抗菌，单独饲养3～4 d自愈。

1.3 测定EGFP荧光表达部位定位注射3周后，使用蠕动泵进行心肺灌注。预先使用预冷的生理盐水灌注2 min,后转为4%多聚甲醛(pH=7.4,Sigma-Aldrich)灌注20 min取材。4℃环境下使用4%多聚甲醛固定6 h，再用30%蔗糖进行脱水，直至沉降到试管底部。

使用冰冻切片机(Slee Medical,Germany)以20 μm 厚度进行连续切片，脑片按不同区域置于含0.01 mol/L PBS (pH 7.4)的12孔板。4℃环境下，使用飘片法(Free-floating)加入 0.4%TritonX-100(Sigma-Aldrich)于300 r/min恒温孵育器(Eppendorf,ThermoMixerTMC)上清洗10 min。用1 mg/L DAPI(Sigma-Aldrich )进行核酸染色5 min。拍照使用Nikon C2 PLUS Confocal(Nikon，Japan) 成像系统在其对应的405 nm (DAPI)、488 nm (EGFP)、561 nm (Dil Stain)以及647 nm (检测假阳性)波段下进行。

2 结果

2.1 高病毒滴度下的扩散情况为研究AAV在核团注射3周后的侵染效果，试验首先选用1.3×1011mg/L 这一较高滴度进行试验。结果显示，经普通注射方式，该滴度虽然有效地在第3周时表达了病毒载体所携带的EGFP荧光蛋白基因，但并不局限于延髓RPa区域及临近区域。在下丘脑室旁核(paraventricular nucleus,PVN) 区域及其周围，较多的特异性荧光信号被发现(图1)。同样，这种广泛的表达情况也存在于四脑室周围的孤束核(nucleus of the solitary tract,NTS)区域(图1)。延髓中缝苍白核 (raphe pallidus nucleus,RPa)区域及其周围相较于前脑PVN区域，可见更为清晰的荧光信号(图1)。

这一结果显示了AAV在1.3×1011mg/L 滴度下可有效在3周内由延髓RPa区域侵染至前脑PVN区域，这达到了利用腺病毒进行远距离跨神经元示踪的要求。但是，同样也提出了另外一个问题，如果要使用腺病毒进行中枢神经系统的局部基因敲除或特定区域的激活、上调，这种大范围、多核团的外源基因表达结果显然不符合试验设计的要求。

AⅠ.下丘脑PVN及其周边区域荧光表达状况；AⅡ.下丘脑PVN阴性结果；BⅠ.NTS区域荧光表达状况；BⅡ.NTS区域阴性结果；CⅠ.RPa区域荧光表达状况；CⅡ.RPa阴性结果

2.2 低滴度下2种不同脑立体定位注射方式的对比除降低注射滴度外，注射方式可能也会影响到AAV表达情况。为了尽可能将病毒载体局限于某个神经核团周围，较低剂量的AAV(1.3×108mg/L)被注射在延髓区域(图2A)。当以0.25 μL/min速度注射4 min、停针2 min的普通注射方式进行定位注射后，AAV在第3周的表达较弱、荧光值相对较低，难以与荧光背景进行区分(图2B)。当以0.1 μL/min速度注射10 min、停针10 min的压力注射方式进行定位注射后，AAV在第3周的表达状况得到了一定的好转，荧光信号更加清晰(图2C)。结果表明，采用0.1 μL/min速度注射10 min，停针10 min 的方式进行注射，相比较之前的试验结果(图1)，腺病毒在脑内的表达范围被明显限制(图2D～F)。

2.3 病毒载体EGFP表达结果及其非特异性荧光情况在使用较低滴度(1.3×108mg/L) 和压力注射等方式后，可将病毒在3周内的侵染范围限制在局部区域(图3)并获得较好的荧光蛋白表达结果。此外，在使用EGFP(488 nm波长激发)具有较清晰结果的扫描参数进行成像的过程中，637 nm 激光通道未见明显的非特异性荧光信号。由于AAV的荧光信号常与其他通道信号共同使用以表明病毒的工作状态(如敲除，或特异性神经元调控)。因此，这一结果预示在AAV和其他波段荧光信号共表达的试验设计中，使用低滴度、压力注射的方式对获得清晰可靠的试验结果具有一定的积极作用。

3 讨论

目前，AAV配合Cre-Loxp重组系统在神经元的在体功能研究中被广泛应用。利用以Cre-Loxp为首的重组系统发展而来的DREADDs技术可通过Gq、Gi和Gs(如hM3Dq、hM4Di和GsD)信号传导途径，在体内环境下，对多种细胞进行中远程和非侵入性控制，达到激活、抑制和调节GPCR信号传导途径以及神经传递的目的[10-11]。而AAV依靠其安全性高、侵染性强、表达稳定等特点为这一技术的推广做出了巨大贡献。如若由此进一步思考，那么保证AVV有效侵染和表达的区域集中于目标核团就成为了利用DREADDs对特定神经元调控成功与否的关键。

本试验结果表明，病毒在高浓度情况下，其3周的扩散范围几乎可以从延髓区域扩散至前脑下丘脑区域。这样的扩散速率和覆盖范围显然有利于使用AAV对特定神经元进行全脑的定位，为研究特定的神经通路和神经连接提供帮助[12]。但是，如果试验目的定位在特定神经核团，如标定和激活弓状核(arcuate nucleus,ARC)区域的刺鼠相关蛋白(agouti-related peptide,AgRP)神经元[13]，那么限制病毒在注射核团周围就成为了数据是否稳定的关键。

A.注射部位(DAPI蓝色，Dil 绿色)；B.0.25 μL/min速度注射4 min，停针2 min方式注射3周后结果；C.0.1 μL/min速度注射10 min，停针15 min方式注射3周后结果；D.压力注射3周后PVN区域EGFP荧光表达；E.压力注射3周后注射区域附近EGFP荧光表达；F.压力注射3周后RPa区域EGFP荧光表达

A．病毒载体注射3周后，EGPF表达状况；B.488 nm激光激发下EGFP的局部表达；C.637 nm激光激发下病毒载体非特异性荧光状况

本试验中，采用降低病毒滴度和采用压力注射的方式来限制病毒的扩散范围和确保病毒载体的高效表达。当病毒滴度降为1.3×108mg/L时，病毒的扩散范围和表达效果受到了一定的减弱(图2B)，但是这种表达因其外源基因表达量较低，难以充分发挥出腺病毒高表达效率的特点。因此，在进一步的试验中，采用了压力注射的方式，期望以较低的注射速度和较长的停留时间使得注射部位可以有较多的病毒载体存在。相比普通核团注射方式，这种注射方式可以使得病毒载体的表达效果得到一定的提升，并且病毒载体在3周后的扩散范围也基本停留在注射核团附近。因此初步认定，降低病毒滴度至1.3×108mg/L并配合压力注射的方式，可以使得AAV所携带的外源基因在延髓具有高表达和区域性的特点。此外，鉴于AAV中的EGFP基因在应用过程中存在一定的假阳性问题，且高滴度下尤为明显[14]，我们在488 nm和647 nm激发波长下使用相同的成像参数进行了扫描，结果显示在得到较好的外源基因表达结果的参数下，647 nm激发波长下的荧光结果(相比488 nm激发波长)没有出现明显的假阳性现象。

综上所述，在AAV有效性得到保障、外源基因片段对载体干扰性较小的情况下，选择较低滴度的腺病毒(1.3×108mg/L)并结合压力注射的方式可以在一定程度上保证外源基因的高效和区域性表达，且没有明显的假阳性现象。