小鼠肝再生时线粒体蛋白Mic60/OPA1与能量供应的关系

石永泉，刘炜，王柯

（1.大连医科大学基础医学院，辽宁 大连 116044；2.大连医科大学附属第一医院中医科，辽宁 大连 116011；3.大连医科大学附属第二医院临床营养科，辽宁 大连 116023）

肝切除术术后肝衰（post hepatectomy liver failure，PHLF）发生率约为28%，死亡率约为27%，远高于非PHLF患者的死亡率[1]。良好的肝再生是PHLF恢复的重要因素，稳定的能量供应对肝再生至关重要，线粒体嵴膜（cristae membrane，CM）锚定的呼吸链复合体是能量（ATP）生成的主要装置。CM形态可决定ATP合成效率[2]。Mic60和OPA1是主要的CM形态调控蛋白[3]，其表达水平的变化与多种病理生理状态相关[4-6]。目前，关于肝再生中Mic60和OPA1与ATP供应的关系的研究较少。本研究旨在观察残余肝组织Mic60 和OPA1水平与ATP含量的关系，为改善PHLF预后提供新思路，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 C57/6J SPF雄性10周龄WT小鼠购自大连医科大学SPF中心。体视显微镜（wf10/20，宁波永新）；七氟烷（上海恒瑞）；Mic60（ab110329，Abcam）；OPA1（ab157457，Abcam）；HRP 标记山羊抗兔 IgG（#31460，thermoFisher）；COX IV（WL01794）、PCNA（WL02208）、兔抗小鼠IgG-HRP（WLA024）、羊抗兔IgG-HRP（WLA023）、线粒体蛋白提取试剂盒（WLA034a）、BCA 试剂盒（WLA004）购自万类生物；DAB 显色液（DA1010，Solarbio）；增强型ATP检测试剂盒（S0027，碧云天）。

1.2 方法

1.2.1 PH模型 PH模型制作在体视显微镜下完成。课题组前期发现70%PH小鼠7 d生存率可达100%，85%PH组的生存率也很高，因此，本实验选择85%PH作为起始切除比例。将小鼠随机分为对照组（Sham）、85%PH 和 90%PH 组，每组 18 只，每组10只用于生存分析。术前过夜不禁食水。七氟烷持续性吸入式麻醉。手术方法：腹部正中纵行切口，长约2～2.5 cm，暴露整个上腹部。显微剪离断镰状韧带、肝胃韧带、左外叶与右侧膈肌韧带，游离肝左外叶和肝中叶，5-0 慕丝线结扎中叶、左外叶和右下叶后切除。离断肝周韧带游离整个尾叶。若制作85%PH 模型，则结扎并切除尾叶；若制作90%PH 模型，则结扎右上叶并切除。切除后观察肝切面无渗血且残余肝无变暗后，4-0 带针线逐层关腹，消毒切口。Sham 组小鼠开腹放置25min 后直接关腹。术毕小鼠背部皮下注射0.9%氯化钠溶液0.5 mL 后置于复温盒。每组10 只用于统计7 d 生存率，其他小鼠术后24 h取残余肝组织用于后续指标分析。前期发现术后24 h 85%PH小鼠肝组织再生开始明显增强，因此，本研究选择术后24 h作为时间研究点。

1.2.2 免疫组织化学染色 PCNA一抗浓度1∶300。每只小鼠的切片在光镜400 倍视野下随机挑选2 个视野，计数每个视野中的阳性细胞数（n1）和总细胞数（n）的比值均数，即为PCNA阳性百分率。

1.2.3 Western blot 线粒体蛋白的提取严格按照说明书操作：称取肝组织50～100 mg，加入1 mL 试剂A，转入1 mL 玻璃匀浆器中抽拉20 次，4 ℃，1 000 g 离心10 min。上清移至新EP管中，4 ℃，10 000 g离心20 min。将沉淀重悬于试剂B中，4 ℃，10 000 g 离心 10 min，重复 3 次，所得沉淀于试剂 C中裂解即得线粒体蛋白。全程冰上操作。BCA 法测定蛋白浓度。

一抗稀释比例：Mic60和COX IV为1∶500，OPA1为1∶2 500。二抗稀释比例均为1∶5 000。ECL法曝光显影，凝胶图象处理系统（Gel-Pro-Analyzer软件）分析条带光密度值。

1.2.4 ATP 含量测定 按试剂盒说明书操作：每组取3 只小鼠肝组织，冰上分别加入150 μL 裂解液，玻璃匀浆器匀浆 20 次，4 ℃，12 000 g 离心 5 min，留上清。利用 ATP 标准品绘制标准曲线，96 孔板加入100 μL ATP 检测工作液，放置5 min，每孔加入40 μL 样品，每个样品设置3 个复孔，化学发光仪测定RLU值。

1.3 统计学方法 采用GraphPad Prism 7.0软件进行数据分析，计量资料以“±s”表示，生存率比较采用one-way ANOVA，其余指标比较采用非配对t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 7 d生存率 Sham组小鼠术后7 d全部存活。85%PH组术后第2、3天死亡3只，生存率为70%。90%PH小鼠术后24 h内全部死亡。死亡小鼠解剖均未发现明显出血现象，见图1。

图1 PH小鼠术后7 d生存率

2.2 85 %PH组肝再生水平明显升高 HE染色显示两组肝组织均无坏死，85%PH 组脂肪化明显（见图2A），符合再生肝特点。85%PH组PCNA阳性率为0.043，高于Sham组的0.029（见图2A和2B），差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图2 PH小鼠术后24 h肝组织HE染色和PCNA表达情况（400×）

2.3 85%PH肝组织ATP含量明显升高 85%PH肝组织ATP含量为9.74 nM/mg，高于Sham 组的5.48 nM/mg，差异有统计学意义（n=4，P＜0.05），见图3。

2.4 85 %PH 肝组织Mic60 表达水平明显降低 85%PH 组Mic60 水平为0.58，低于Sham 组的1.03，差异有统计学意义（n=6，P＜0.05），见图4B；85%PH 组 OPA1 水平为 1.02，低于Sham 组的1.51，差异无统计学意义（n=6，P=0.0502），见图4C。

图3 术后24 h肝组织ATP含量

图4 术后24 h肝组织Mic60和OPA1表达水平

3 讨论

本研究结果显示，85%PH生存率为70%，显著高于既往研究[7]，术后24 h 85%PH 残余肝再生水平显著升高。85%PH 肝组织ATP含量与肝再生程度呈正相关，高能量供应的机制值得探讨，若能找到干预靶点应用于90%PH 组，或可提高其生存率。

线粒体为细胞增殖和功能维持提供主要所需能量，且与PH术后肝功能恢复相关[8]。线粒体CM在不同生理状态下呈现不同形态。细胞呼吸时CM 变长，凋亡时CM 变宽[9]。CM 形态在不同病理状态下的作用机制及其调控属于较新研究领域，其变化可以改变线粒体超微结构中的酶活性，影响细胞能量代谢[2]。CM形态受多种蛋白调控，Mic60和OPA1是重要成员。降低和过度表达Mic60 能够导致嵴连接点数量变化[10-11]。缺乏OPA1 的线粒体缺少嵴结构[12]。本研究结果显示，85%PH 肝再生能力强、ATP 含量高，而 Mic60 和 OPA1 的表达明显下降。

有研究显示，Mic60 并非其保护性因素，肥厚性心肌病患者心脏的Mic60 表达水平升高近4 倍，在心肌中特定过表达Mic60 的小鼠心肌肥厚程度更高，ROS 生成量更多而氧化磷酸化活性降低[13]。因此，不排除85%PH 组Mic60 降低是促进能量供应的因素，这或可作为PHLF 的干预靶点。之后可在细胞水平改变其表达量，观察细胞能量代谢的变化，结合电镜观察CM形态变化，进一步探索其中的机制。