LAMP在临床上诊断肺结核的应用评价

廖洁，陈小林，李小玲

（1.萍乡市人民医院检验科，江西 萍乡 337000；2.萍乡市人民医院呼吸内科，江西 萍乡 337000）

结核病是在结核分枝杆菌复合群影响下所引发的慢性传染病，具有较高的死亡率，近年来我国结核病发病率逐年上升，因此，对结核病的防控尤为重要[1]。目前，结核病病原学检测主要采用痰涂片培养法及抗酸染色法两种，但传统方法在结核病变原学检测中已无法满足临床早期诊断，因此，寻求快速有效的结核分枝杆菌检测技术在提高疾病诊疗水平中具有重要意义。环介导等温扩增法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是基于恒温扩增的检测技术，在聚合酶等条件下对标本中的结核分枝杆菌复合群核酸片段进行特异性扩增，当扩增产物与核算染料结合后，可发出检测信号，进而判断标本中是否存在病原体[2]。基于此，本研究旨在探究采用LAMP在肺结核中的诊断价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2019年5月至2020年3月在本院进行检查的50 例肺结核和50 例正常对照作为研究对象，其中男57例，女44例；年龄19～76岁，平均年龄（47.60±3.90）岁。

1.2 纳入及排除标准 纳入标准：肺结核患者经胸部CT及X线诊断可见肺部存在活动性肺结核病变，且经支气管肺泡灌洗液检查可见支气管及肺部组织均含有抗酸杆菌；临床资料完整；自愿参与，均签署知情同意书。排除标准：既往存在结核病史；合并凝血功能障碍；参与本研究前7 d使用抗凝药物治疗；伴有严重的肝、肾、心功能异常；病情危重，无法完成研究者。

1.3 方法 所有患者均行LAMP 检测、L-J 培养及痰涂片检查。①LAMP 检测：首先，采集所有患者痰液样本，并于痰液样本内加入4%氢氧化钠溶液，充分震荡混匀后于常温条件下静置15 min。随后使用吸管吸取1 mL 痰液样本，并滴入离心管内，10 000 r/min 离心处理痰液样本10 min，留取试管底部沉淀物，并向内加入浓度为0.9%氯化钠溶液1 mL 洗涤沉淀物。向洗涤后的沉淀物中加入100 mL 核酸提取物，

混合均匀后将其放置于95 ℃沸水中行水浴处理10 min。随后将其取出并快速冷却至室温后行离心处理。取离心处理后的上层清液2 mL 置于反应试管中，并依次向试管内加入20 mL 密封液及1 mL 聚合酶，对该样本行离心处理5 s 后放置于恒温扩增仪中行扩增处理，设置温度为63 ℃，处理时间为40 min，将处理后的样本使用恒温扩增荧光检测仪进行检测。②L-J培养：取4倍体积的4%氢氧化钠溶液溶于痰液标本中，充分震荡并摇匀，将其静置于室温条件下15 min，使痰液完全液化。使用无菌吸管吸取2～3 滴痰液标本，均匀分布于酸性培养基斜面上，并放入37 ℃培养箱内，记录相关结果。③痰涂片检查：行痰涂片检查时需将标本完全干燥，玻片经火焰固定后加入苯酚复红染液后将玻片盖满，染色5 min 后用流水冲洗，随后沥干玻片上水分后滴加脱色液保持1 min，另加亚甲蓝溶液后染色30 s，干燥后行镜检检查。

1.4 观察指标 以痰涂片检查作为诊断肺结核金标准，分析LAMP、痰培养在肺结核中的诊断价值，包括灵敏度、特异度、准确度等。LAMP阳性判定标准：痰液样本的扩增曲线呈S型，其数值高于样本中含有的结核分枝杆菌复合群。LAMP阴性判定标准：痰液样本扩增曲线呈斜直线型或横直型。

1.5 统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行数据处理，计数资料用率（%）表示，采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。用Kappa 一致性检验对结果进行统计，Kappa 系数越高，提示诊断一致性越强。

2 结果

2.1 不同方法在肺结核组中检出结果比较 50 例肺结核组患者中LAMP 共检出阳性50 例，阳性率为100.00%（50/50）；L-J 培养共检出阳性 39 例，阳性率为 78.00%（39/50）。LAMP 结核分枝杆菌阳性检出率中高于L-J 培养，差异有统计学意义（χ2=4.051，P=0.044），见表1～2。

2.2 诊断价值 LAMP检查在诊断结核中灵敏度、阴性预测值均高于L-J培养，差异有统计学意义（P＜0.05）；LAMP检查与L-J培养诊断肺结核的特异度、准确度及阳性预测值比较差异无统计学意义，见表3。

表1 肺结核组在LAMP检查结核分歧杆菌阳性中的检查结果（n）

表2 肺结核组在L-J培养中结核分歧杆菌阳性中的诊断价值（n）

表3 肺结核组在LAMP检查及L-J培养结核分歧杆菌阳性中的诊断价值（%）

3 讨论

肺结核是临床上常见的严重传染病，在临床疾病检测中，将结核病列为重大传染病的检测范围内，故加强疾病的检测对尽早诊治呼吸道结核病具有重要意义。现阶段，在诊断结核病中主要依靠结核杆菌培养基涂片抗酸染色，但在临床操作中使用结核杆菌涂片抗酸染色检出率较低，仅30%左右，无法及时检出更多的结核病患者，加之结核杆菌的培养耗时较长，周期约为12～26 d，故无法满足临床早期诊断结核病的要求[3-4]。

LAMP在检测结核分支杆菌中无需昂贵、特殊设备，可在1 h内对痰液标本内是否存在结核分支杆菌进行检测。根据结核分支杆菌上DNA上存在的6个区段，设计4个不同引物，同时在链置换反应下大量扩增目标DNA，且其扩增效率较高，可将靶序列扩增至×109～1010倍[5]。因反应液中加入了LAMP反应核酸染料，当溶液中出现大量的焦磷酸根时，则提示结核分枝杆菌为阳性，溶液中的镁离子将取代锰离子后与钙黄绿素鳌合，此时可凭肉眼在日光灯下便可对结果进行判定。若溶液中含有扩增产物，则反应混合物发生颜色变化；反之，则可保持橙色不变[6-7]。本研究结果显示，50例肺结核组患者中LAMP共检出阳性50例，阳性率为100%（50/50）；LJ培养共检出阳性39例，阳性率为78.00%（39/50）。LAMP结核分枝杆菌阳性检出率中高于L-J 培养，差异有统计学意义，LAMP检测在采样时直接使用支气管刷进行采样，可在直视条件下明确取材部位，操作可控性较好，在检测病原菌中优势较明显。LAMP 检查与L-J 培养在诊断肺结核中并非完全一致，分析其原因在于LAMP检查时，需将标本行离心处理后再进行检测，而L-J 培养未进行离心处理，从而造成载菌量存在差异，影响检测结果；其次，LAMP 在测定结核分枝杆菌DNA时，无论活菌还是死菌均可检出，而L-J培养仅可检出活的结核分枝杆菌。此外，L-J培养时标本需经氢氧化钠溶液处理，一定程度上影响结核分枝杆菌的活性，易导致结核分枝杆菌死亡，使得L-J培养阴性而LAMP检查呈阳性[8]。

综上所述，LAMP 在诊断肺结核中结核分枝杆菌阳性检出率较高，具有操作简单、准确简便等优势，且灵敏度较高，可用于结核病早期的诊断。