复配ω-3/ω-6不饱和脂肪酸对高龄小鼠的认知保护

熊旺，姜荷，华家才，何光华，楚秉泉，肖海龙，肖功年

（1.浙江科技学院生物与化学工程学院，杭州310023；2.杭州市食品药品检验研究院，杭州310000；3.贝因美婴童食品股份有限公司，杭州310000）

0 引 言

多不饱和脂肪酸能调节人体脂质代谢、治疗和预防心脑血管疾病、促进生长发育及延缓衰老，具有多种生理功能[1-2]。大量实验[3-4]证明，摄入一定量不饱和脂肪酸的动物，其行为学实验的成绩较好。也有研究者用衰老的小鼠做实验，证明摄入一定量的DHA能够减缓认知能力的下降[5-6]。

ω-6与ω-3多不饱和脂肪酸对人体健康具有协同作用，研究摄入不同比例的ω-6和ω-3 PUFAs对人体健康尤其是高龄群体大脑健康的影响具有重要意义。DHA和AA是脑部重要的营养物质，与学习记忆密切相关[7]。本文以富含DHA和AA油脂作为主要不饱和脂肪酸源，通过一系列行为学和生理实验来研究其不同配比的饲喂对中老年小鼠认知与记忆力方面的影响，为开发预防记忆力下降的中老年配方奶粉奠定基础。

1 实 验

1.1 实验动物及饲养环境

来自杭州市实验动物中心的12月龄ICR小鼠60只，全为雄性，体质量（48±5）g。饮水及饲料经高温蒸汽灭菌，饲料为购买的实验鼠维持饲料，饲养期间小鼠自由饮食。动物饲养在杭州市食品药品检验研究院，动物及相关设施均通过合格。动物室温度22～26℃，相对湿度维持在60%±10%，12 h光/12 h暗循环下饲养。

1.2 材料与仪器

本研究所用到的油脂是从嘉必优生物科技有限公司购买的DHA藻油和AA藻油以及从市面上购买的棕榈油，根据GB 5009.168-2016气相色谱法测定其脂肪酸组成如表1所示。实验所用到的试剂盒均购自南京建成生物科技有限公司，包括TG，TC，HDL-C，T-SOD，MDA及Aβ-40淀粉样蛋白试剂盒。

主要仪器：Morris水迷宫系统，上海欣软科技有限公司；Y型小鼠迷宫，上海欣软科技有限公司；酶标仪，美谷分子仪器(上海)有限公司；岛津气相色谱仪。

表1 实验中3种油脂的主要脂肪酸组成（质量比）

1.3 方法

1.3.1 动物饲养与剂量分组

将实验小鼠分为6组，每组10只，根据ω-3/ω-6不饱和脂肪酸的不同配比进行分组，所有试验组灌胃1.0 g/(kg·d)的复合油脂，以棕榈油灌胃组作为同等热量的对照，以灭菌的蒸馏水作为空白对照，灌胃剂量都为1g/(kg·d)，具体分组如表2所示。动物在实验前适应性饲养5 d，每周称量1次体重，调整给药量，灌胃一共持续6周。

1.3.2 小鼠Morris水迷宫实验测试

给药第6周开始进行Morris水迷宫测试[8-10]，为期6 d，期间持续给小鼠灌胃油脂。Morris水迷宫包括定位航行实验和空间探索实验。圆形水池直径为120 cm，水池高55 cm。水温（23±2）°C，水深26 cm，分为东南、西南、西北、东北4个象限，在4个象限高于水面的内壁上分别贴上不同形状的标识物，实验期间保持室内环境和摆设不变。透明平台直径8 cm，放置在东南象限中央的水面下1 cm，迷宫上空通过摄像机追踪小鼠轨迹。通过定位航行实验进行历时5 d的游泳训练（前一天让小鼠适应性自由泳90 s)。

表2 小鼠灌胃分组 g/（kg·d）

每天将小鼠面向池壁分别从不同象限放入池中，每个象限1次，共4次，每次间隔10 min，记录每次的潜伏期(s)，计算平均值。潜伏期是指小鼠找到平台所花的时间。若小鼠在60 s内未找到水下平台，则引导其登上站台适应10 s（潜伏期记为60 s）。空间探索实验是在定位航行实验后去除水下平台，记录小鼠在60 s内穿过平台所在位置的次数和停留在目标象限（东南象限）的时间（图1）。

图1 水迷宫示意图

1.3.3 小鼠Y迷宫行为测试

Y迷宫测试[11]在Morris水迷宫测试结束的后1 d进行，Y迷宫由3个相同的有色臂组成（8 cm×30 cm×15 cm），相邻臂之间的角度为120°，每个臂的末端都装有一个挡板控制开关。3只臂被指定为：起始臂（总是打开，小鼠每次探索迷宫的起始点；其它臂（始终打开）；新异臂（在第1次实验中被挡住，在2次实验开始前打开）。在迷宫的内壁上贴上不同形状的标志物供小鼠识别。Y迷宫试验由两个部分组成，间隔1 h。第一次部分试验持续5 min，让老鼠自由探索两臂（起始臂和其它臂），封锁新异臂。在第二部分试验也持续5 min，3只臂同时打开，将小鼠放在起始臂前端，使小鼠可以自由探索所有臂。每次试验后，将迷宫内壁清理干净，以去除嗅觉信号。实验由安装在迷宫上方的摄像机记录并分析。统计首次进入新异臂的小鼠个数以及每只小鼠分别进入新异臂和其它臂的总次数。

1.3.4 生化指标的测定

小鼠行为学实验完成后，禁食不禁水12 h后脱颈椎处死，主动脉取血然后于冰浴中迅速分离大脑，脑组织加入9倍生理盐水进行匀浆，3 500 r/min离心10 min，取上清液保存。按试剂盒说明步骤测定大脑Aβ-40淀粉样蛋白水平，试剂盒标曲用ELISA数据处理软件做Logistic4参数曲线拟合。同时用TG、TC及HDL-C试剂盒测定小鼠血脂水平，T-SOD、MDA试剂盒测定血清、大脑组织的过氧化水平。

1.3.5 统计学分析

使用SPSS 18.0统计软件对数据进行处理,实验结果以x±SE表示,各组之间的比较采用单因素方差分析，以P＜0.05表示有统计学差异。

2 结果与讨论

2.1 Morris水迷宫实验

2.1.1 定位航行实验

图2为复配不饱和脂肪酸油脂对高龄小鼠在水迷宫中潜伏期的影响。

如图2所示，随着训练的进行，所有的小鼠都学会了在60 s内找到隐藏的水下平台。在第1天训练中，各组小鼠寻找平台的平均潜伏期无明显差异；从第2天开始，随着训练次数的增多，各组小鼠寻找平台的潜伏期均呈下降趋势，但各组间无明显差异（P＞0.05）；从第3天开始，各组间表现出了差异，其中，C组和D组较A和B两组（对照组）潜伏期明显缩短（P＜0.05），且随后几天组间差距并没有缩小，而E和F两组虽然表现优于对照组，但无显著性差异（P＞0.05）。这说明高含量的不饱和脂肪酸摄入有利于缩短中老年小鼠的逃避潜伏期，增强空间记忆能力，且ω-3较优于ω-6不饱和脂肪酸。

2.1.2 空间探索实验

水迷宫中目标象限停留时间和跨越平台次数可以反映小鼠的空间记忆能力，认知及记忆能力好则小鼠会来回的在平台周围搜索，目标象限停留时间明显增加。如表3所示，不饱和脂肪酸油脂组（C，D和E组）在目标象限停留时间和跨越平台次数明显高于对照组（P＜0.05），且D组（DHA藻油/AA藻油=1∶1）整体表现最好。

2.2 Y迷宫新异臂探索实验

新异臂探索实验[12]是利用小鼠对新异环境天然探究的能力来研究其记忆认知能力的，无需外界的刺激。当允许在新异臂和其它臂之间进行选择时，具有较好的空间记忆的小鼠，会更多的进入新异臂。图2(a)中，对新异臂首次进入的小鼠个数分析，只有C组和D组小鼠对新异臂表现出明显的偏好性（P＜0.05），小鼠总数相同的情况下，首次进入新异臂的小鼠数量最多。小鼠总进臂次数无明显差异，活动能力相同，图2(b)中，多不饱和脂肪酸组（C组和D组）对新异臂表现出了更大的兴趣，进入次数明显最多（P＜0.05）。

表3 复配不饱和脂肪酸油脂对小鼠穿越平台次数和目标象限停留时间的影响

图3 复配多不饱和脂肪酸对高龄小鼠Y迷宫新奇事物探索能力的影响

2.3 小鼠生化指标分析

在给药期间，各组小鼠体重变化无明显差异，脏器指数均无明显差异。所有实验小鼠胸腺明显萎缩。

2.3.1 小鼠血脂水平分析

长期高膳食饱和脂肪酸会引起血脂水平的升高，提高机体氧化应激水平[13]，进而加快机体的氧化损伤，但本研究中小鼠血脂水平没有明显差异（P＞0.05），这可能是因为实验时间过短，同时也说明较高剂量的多不饱和脂肪酸油脂摄入不会引起血脂水平的明显升高，见表4。

2.3.2 氧化应激水平

与棕榈油组（A组）相比，多不饱和脂肪酸油脂组大脑与血清的MDA水平显著降低(P＜0.05)，D油脂组大脑T-SOD水平显著升高(P＜0.05)。说明多不饱和脂肪酸油脂对小鼠机体有抗氧化作用，见表5。

表4 小鼠血脂水平 mmol/L

表5 小鼠体内过氧化水平

2.3.3 小鼠大脑Aβ-40淀粉样蛋白质量浓度分析

Aβ蛋白与老年斑的形成有关，老年人体内Aβ蛋白质量浓度会明显增加。AD的发病与脑内Aβ淀粉样蛋白异常沉淀也有关。Aβ对周围的突触和神经元具有毒性作用，可导致神经细胞变性死亡，随着神经元的变性坏死,导致脑内相应的神经递质水平下降，从而引起记忆力的衰退[14-15]，见表6。

表6 复配多不饱和脂肪酸油脂对高龄小鼠大脑Aβ-40淀粉样蛋白水平的影响 ng/L

如表6所示，不饱和脂肪酸油脂能显著降低高龄小鼠大脑组织中Aβ-40淀粉样蛋白水平（P＜0.05），C、E两组与对照组B相比差异极其显著（P＜0.01）。对照组中棕榈油组与蒸馏水组相比，Aβ-40蛋白含量也有明显下降（P＜0.05），可能是棕榈油中含有其它丰富的不饱和脂肪酸，而小鼠日常的维持饲料脂肪酸供给不足。

3 结束语

通过Morris水迷宫法与Y迷宫法，从不同的角度观察了经多不饱和脂肪酸灌胃后小鼠的学习记忆能力及相应变化。同时，在迷宫实验完成后测定小鼠大脑Aβ-40淀粉样蛋白水平和过氧化水平作为迷宫实验的补充。结果说明：多不饱和脂肪酸可以保护高龄小鼠认知及记忆能力，且ω-3可能比ω-6多不饱和脂肪酸更有效，但综合ω-6不饱和脂肪酸的重要作用[16]，合理的脂肪酸营养配比是十分重要的，本实验中D油脂组（DHA藻油/AA藻油=1∶1）小鼠整体表现最好。大脑的记忆是一个非常复杂的过程，虽然在本实验中展现出了复配ω-3/ω-6不饱和脂肪酸在高龄小鼠衰老过程中记忆力良好的保护作用及抗氧化损伤作用，但两者的关联和作用途径还需要进一步研究，以便为中老年配方奶粉中脂肪酸的添加提供更好的依据。