杯碟法中藤黄微球菌的添加方式对生鲜乳中β-内酰胺酶检出限的影响

刘旸，张丽宏，房玉国，王胜男，王淼，黄艳玲

（1.黑龙江省绿色食品科学研究院哈尔滨150028；2.黑龙江省标准化研究院哈尔滨150028）

0 引 言

在畜牧养殖环节，有些不法商贩为获得更多利益，不但对患病的奶牛滥用抗生素，而且对处于治疗过程中的奶牛进行榨奶[1-2]，这就造成生鲜乳中残留有抗生素。为达到分解残留的抗生素目的就会采用生鲜乳中添加β-内酰胺酶[3-5]。β-内酰胺酶作用于抗生素产生的噻唑酸物质会导致人体发生过敏反应[6-8]。虽然现在人们开始重视β-内酰胺酶的添加对生鲜乳的品质有不良的影响，但是近几年关于β-内酰胺酶检验的研究并不是很多。早在2009年我国就将β-内酰胺酶列为违禁添加物，不得检出[9]。关于β-内酰胺酶检测方法有很多种，但主要还是采用微生物检测方法。其中的杯碟法因其结果准确、特异性强、重现性好被列为β-内酰胺酶检测的标准方法[10]。

2009年卫生部发布的《乳及乳制品中舒巴坦敏感β-内酰胺酶类药物检验方法:杯碟法》和2018年实施的NY/T 3313-2018《农业行业标准生乳中β-内酰胺酶的测定（第一法杯碟法）》，都是采用杯碟法测定生鲜乳中的β-内酰胺酶含量。虽然两个方法标准中添加藤黄微球菌的方式略有不同，但是却是国内一直公认的微生物检验方法。2009年卫生部发布的方法，在当时是唯一能够确证试剂盒检验β-内酰胺酶的方法，以避免试剂盒检验出现假阳性的判定。2018年发布的NY/T 3313-2018虽然在标准加入“第二法胶体金快速试纸条法”检测方法，但是在该方法中明确规定了要用“第一法杯碟法”确证后，才能上报“β-内酰胺酶检出”。杯碟法在所有检测β-内酰胺酶的方法是成本最低的，但是也是操作起来最繁琐的。2018年实施的NY/T 3313-2018《农业行业标准生乳中β-内酰胺酶的测定（第一法杯碟法）》中就是简化了藤黄微球菌的添加方式。但是两种方法判定生鲜乳中是否添加了β-内酰胺酶的判定方式是相同的，都是观察A、B两个抑菌圈的差值来判定。所以能灵敏的检测出越低浓度的β-内酰胺酶和清晰的观察到抑菌圈以便于能够准确的测出A、B两个抑菌圈的差值是很有研究意义的。国外关于这方面的研究几乎没有，而且在国外一直也没有相关的标准方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氯化钠（AR，Lot 20150615），天津市科密欧化学时间有限公司；无水磷酸二氢钾（Sigm a-VETEC），西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；无水磷酸氢二钾，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；营养琼脂培养基，北京陆桥技术股份有限公司；抗生素检定培养基Ⅱ，广东环凯微生物科技有限公司；β-内酰胺酶标准品（Sigm a），西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；舒巴坦标准品（D r Ehrenstorfer Gm bH）、青霉素G标准品（Sigm a-Fluka），西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。

1.2 仪器与设备

生化培养箱，MEMMER T；紫外可见光分光光度计，上海光谱仪器；电子分析天平，北京赛多利斯；游标卡尺，杭宇。

1.3 方法

1.3.1 菌悬液的制备

将实验用菌株藤黄微球菌（Micrococcus luteus,CMCC(B)28001）（中国工业微生物菌种保藏管理中心(C ICC)），接种于营养琼脂培养基斜面上，37±1℃，培养18～24 h，连续传三代备用。将活化好的藤黄微球菌，用无菌8.5%生理盐水从斜面上洗下来，制成实验用菌悬液[11]。用紫外分光光度计在450 nm的波长下测其200倍稀释液，吸光度值约为0.89，即终浓度为1×1010CFU/m L[10,12]。

1.3.2 模拟样品的制备

由于对于β-内酰胺酶稳定性的研究很少[11,14]，通常采用现用现配的方式制备β-内酰胺酶模拟样品。将0.01 U/m L的β-内酰胺酶标准溶液用无菌无抗无β-内酰胺酶的纯牛奶[15-17]进行定容稀释，分别配制成含有 0.001、0.0005、0.00025、0.0002、0.0001、0.00005 U/m Lβ-内酰胺酶模拟样品[18-20]。空白样品为无菌无抗无β-内酰胺酶的纯牛奶（250 m L，保质期室温6个月），水系为去离子纯水。

1.3.3 测定用培养基平皿的制备

方法一：取菌悬液（1.4）1 m L加入到灭好菌的100 m L、温度在46～50℃之间的抗生素检定培养基Ⅱ中，充分混匀，菌悬液最后终浓度为1×108CFU/m L；每个无菌培养皿中分装15 m L培养基，静置；待凝固后，将培养皿平分成四区，每区中央放置灭好菌的牛津杯，待稳定后加样。

方法二：每个无菌培养皿中底层先加入10 m L灭好菌的抗生素检定培养基Ⅱ，作为培养基基础。待冷却凝固后，上层再加入加入5 m L含有浓度为1×108CFU/m L的菌悬液的抗生素检定培养基Ⅱ（配制方法参考方法一），静置；待凝固后，将培养皿平分成四区，每区中央放置灭好菌的牛津杯，待稳定后加样[21]。

1.3.4 标准溶液配制

称取8.0 g无水磷酸二氢钾、2.0 g无水磷酸氢二钾，溶解于水中，用盐酸（0.1 m ol/L）调节pH至6.0，定容至1 L，于121℃高压灭菌15 min，为磷酸盐缓冲液。用配制好的磷酸盐缓冲液将β-内酰胺酶标准品、舒巴坦标准品、青霉素G标准品分别配制成0.1 U/m L、1 m g/m L、0.1 m g/m L标准溶液。

2 结果与分析

根据《NY/T 3313-2018生乳中β-内酰胺酶的测定（第一法杯碟法）》中“试样测定”的规定，在1 m L水系、空白、添加β-内酰胺酶模拟样品中加入β-内酰胺酶标准溶液、舒巴坦标准溶液、青霉素G标准溶液体系，添加方式如表1。

表1 标准溶液体系的添加

将培养皿于37℃，培养22 h后，按照标准中“试验数据处理”进行判定。在实验结果判定之前，应先确定水系及空白试验结果成立。然后再根据模拟样品中β-内酰胺酶浓度的不同，在测量抑菌圈进行判定[22-23]。

2.1 结果的判定

当水系、空白试验结果满足如下条件时，样品结果应按以下规则进行判定：

（1）若B和D均产生抑菌圈，且C的抑菌圈小于D的抑菌圈，差异≥3mm时：A的抑菌圈小于B的抑菌圈，满足抑菌圈差异≥3mm时，该结果判定为检出β-内酰胺酶；2次平行测定同时满足A的抑菌圈与B的抑菌圈差异＜3mm时，该结果判定为未检出β-内酰胺酶。

（2）若A和B均不产生抑菌圈，应将样品稀释后再重新进行测定。

2.2 抑菌圈的测量

由表2、表3可知，方法一与方法二的水系都成立，空白样品也都为β-内酰胺酶未检出，可见整个实验测定体系成立。阳性对照分别选用了添加β-内酰胺酶时，最接近“A的抑菌圈小于B的抑菌圈，满足抑菌圈差异≥3mm”这个条件的浓度，即方法一β-内酰胺酶阳性添加浓度为0.00025 U/m L，方法二β-内酰胺酶阳性添加浓度为0.0001 U/m L。但是可以看出方法一的抑菌圈边缘比较模糊，在用游标卡尺进行测量时，不好测定。方法二的抑菌圈的边缘就很清晰，测量方便，便于肉眼观察。在相同培养温度、培养时间的条件下，方法一的藤黄微球菌在培养基中生长的情况比方法二也较稀疏。

表2 方法一水系与空白实验的判定

表3 方法二水系与空白实验的判定

2.3 检出限的测定

在水系成立、空白样品成立的前提下，同时进行方法一和方法二的检出限的比对，如表4所示。

表4 方法一与方法二的检出限的比对

方法一的β-内酰胺酶检出限在0.0002～0.00025 U/m L之间，方法二的β-内酰胺酶检出限在0.00005～0.0001 U/m L之间，由此可见方法二的灵敏度明显高于方法一的灵敏度。但是方法一的藤黄微球菌添加方式相比于方法二操作简单。

通过比对研究，两种藤黄微球菌的添加方式，对β-内酰胺酶的检出限和实际观察测量抑菌圈有影响。通过分析，方法一中藤黄微球菌在15 m L培养基里，处于培养基内部，呈分散的状态，要克服琼脂的张力的作用；同时藤黄微球菌是好氧菌，其耗氧量也受到影响，造成藤黄微球菌在相同的培养条件下生长的不够充分，在培养基中含量较少，是造成抑菌圈的边缘模糊的主要原因。方法二中菌悬液5 m L的培养基覆盖在10 m L的培养基基础上，相比于方法一培养基的营养含量减少了2/3，但下层的10 m L的培养基也会为上层菌悬液提供营养，菌悬液只要克服5 m L培养基的张力，而且处于培养基上层，几乎不影响藤黄微球菌微球菌耗氧量。所以在相同实验条件下，方法二的藤黄微球菌在培养基中能够充分生长，菌含量浓度较大，抑菌圈更加清晰。在相同的培养条件下对β-内酰胺酶的灵敏度更高，反应时间更短，检出限更准确。

3 结 论

β-内酰胺酶是明令禁止添加到生鲜乳中的违禁添加物，虽然杯碟法中藤黄微球菌这两种添加方式对β-内酰胺酶检出限的区别很小，但是对生鲜乳中β-内酰胺酶检测有深远意义。

因为按照农业农村部要求，β-内酰胺酶检验检测时间为18～22 h。如果在相同时间内藤黄微球菌生长的越充分，抑菌圈越清晰，对β-内酰胺酶的灵敏度越高，对β-内酰胺酶的检出更加准确。此外，对于各检验机构在参加β-内酰胺酶能力验证或该项目考核时，对于样品制备和邮寄过程中产生的β-内酰胺酶样品衰减的问题，对检测结果的正确性也具有一定影响[24]。同理，对于乳品企业采用快速试纸条初筛出β-内酰胺酶阳性的样品，要第一时间采用杯碟法进行确认，以免快速试纸条的假阳性造成的错判。含有β-内酰胺酶的生鲜乳样品由于温度的变化，存放的时间长短，以及冷冻样品反复冻融的影响，都会增加β-内酰胺酶衰减的风险。所以，提高β-内酰胺酶的检出灵敏度，对乳制品安全也具有重要意义。