几种映山红杂交杜鹃茎段快繁体系的建立

朱春艳，盛小光，励敏，周绍荣，陈霞，顾宏辉

(1.杭州植物园，浙江 杭州 310013；2.杭州西湖园林科学研究院，浙江 杭州 310013；3.浙江省农业科学院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

杜鹃花是杜鹃花科杜鹃花属(RhododendronL.)植物，别名映山红、满山红、照山红、山石榴、山踯躅等，是世界三大天然名花之一，也是我国传统十大名花之一。全世界有杜鹃花900多种，产于中国的有近600种，其中400种是我国特有。杭州植物园自1956年建园以来，一直重视杜鹃花资源的收集和应用研究，其土壤属红壤和黄壤，pH 4.9～6.5，为杜鹃花研究提供了良好的条件[1]。

20世纪90年代初，杭州植物园把筛选出的杜鹃花种、品种和自选育杂交组合的3 000多株杜鹃栽植于玉泉景点西南面，以杜鹃花为主的各种植物配置，建设了占地约3 hm2的杜鹃花专类园。其中雪粉和雪翠2个新品种于2016年获得植物新品种授权。杭州植物园广泛开展了杜鹃属的种内杂交和种间杂交，杂交组合超过300个，为开展杜鹃花育种研究积累了一定的基础和丰富的经验，尤以映山红(杜鹃花属的一种)为亲本的杜鹃花育种取得成效。杭州植物园选择我国分布最广、抗性最强且在我园引种驯化成功的野生映山红做母本，以贵妃醉酒、红霞、玉玲、月白风清等色彩鲜艳、观赏价值高的杜鹃为父本，所配的组合不仅表现明显的亲合性，而且每个组合的杂交F1具有明显杂种优势，体现在花色、花大小、花期、株型以及抗性等方面。近年来新育成了映玉1号、映玉2号、玉映、映紫等映山红类杂交杜鹃。随着对新育成杜鹃品种的大规模生产需求，品种规模化生产成为产业化的关键技术。

目前，杜鹃花的繁殖方式主要采用播种、扦插和嫁接等[2]，存在季节、环境的制约性大、繁殖系数低、成活率低等问题，难以进行大规模推广生产。应用组织培养技术进行杜鹃繁殖，具有繁殖速度快、系数高、季节影响低等特点，对于珍贵优良杜鹃品种的引进和规模化生产具有重要意义。

本文在前期组培快繁技术的基础上[2-3]，对新育成的映山红进行组培快繁技术研究，成功利用新发枝条的茎段外植体诱导出了丛生芽，并且实现了瓶苗的正常生根，为新品种组培快繁生产技术奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为杭州植物园育成的映山红杂交杜鹃，编号1、2、3和4，分别为映玉1号、映玉2号、玉映和映紫。

1.2 外植体灭菌

在春季4—5月，摘取母株中的新发嫩枝为外植体。剪去叶柄基部，去除所有叶片，将外植体剪成2～3 cm长的茎段备用。在自来水中冲洗约1 h，再用70%的酒精浸泡10 s，随后在0.1% HgCl2溶液中振荡灭菌12～15 min，最后用无菌蒸馏水冲洗3～4次，用灭菌滤纸吸干备用。

1.3 丛生芽诱导

将灭好菌的备用枝条切除茎尖，余下的枝条剪成约1 cm长的茎段，每段带有1～2个腋芽节，接种到WPM丛生芽诱导培养基上[2-3](添加不同浓度的反-玉米素，30 g·L-1蔗糖、8 g·L-1琼脂，pH约4.3)。于25～28 ℃光培养(16 h)25～35 d，茎段腋芽长至2～3 cm后，切取新发腋芽并切除茎尖，移入上述WPM诱导培养基上进行增殖培养，相同的温度和光照条件下培养30～40 d后，腋芽基部生长出丛生芽(图1)。

图1 映山红1号(试验编号R60)丛生芽诱导

1.4 瓶苗根的诱导

从诱导出的丛生芽中切取生长粗壮的枝条，接种于添加不同浓度的吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)和萘乙酸(NAA)的WPM基本培养基上，于25～28 ℃(16 h)，光培养约25 d，诱导生根。

2 结果与分析

2.1 外植体腋芽诱导分化情况

供试的4个杜鹃品种均能被成功诱导，平均诱导率为45.3%～61.5%。灭菌好的外植体，约有30%在接种后1周内发生污染，另有约10%会在接种后2～4周内发生污染，另有5%～10%的外植体虽然没有发生污染，但可能因为灭菌过程中受到伤害而没有萌发。

外植体中的腋芽能在添加0.5～3.0 mg·L-1trans-ZT的WPM培养基中被诱导萌发，腋芽的萌发速度会随着trans-ZT的浓度的增加而加快。接种约14 d后，腋芽处开始膨大萌动。约30 d后，形成带有2～3张叶片的小枝条。约60 d后，形成带有6～8张叶片，长度达2～4 cm的小枝条。将新诱发的无菌枝条切成带有1～2个腋芽的茎段，移入增殖培养基进行丛生芽诱导培养，约50 d后在每一腋芽处诱导出数个新的枝条(表1)。

表1 4种映山红杂交杜鹃侧芽诱导和增殖情况

2.2 培养基对丛生芽诱导的影响

2.2.1 不同类型的WPM培养基对枝条增值诱导的影响

以往研究结果表明[2-3]，WPM基本培养基是杜鹃枝条增殖较为适宜的培养基，本研究选用了两种类型的WPM培养基，基本成分一样，但配制形式不同。一是配制大量、微量、有机和铁盐等物质的母液，量取不同体积的母液配制成WPM工作液(WPM-1)。二是购得末状固体，取2.47 g粉末即可配制1 L的WPM工作液(WPM-2和WPM-3)。总体而言，两种类型的WPM培养基对杜鹃枝条增殖的效果差异不显著，但也存在细节上的区别，如WPM-2和WPM-3培养基上杜鹃枝条增殖系数略低于WPM-1培养基，但是其诱发的枝条相比更为粗壮(表2)。

表2 不同培养基对杜鹃枝条增殖的影响

2.2.2 丛生芽激素浓度对枝条增殖的影响

含有不同浓度的trans-ZT的WPM培养基，对杜鹃枝条的繁殖系数及生长情况产生显著影响。总体而言，随着trans-ZT浓度的增加，枝条的繁殖系数提高。但相对较低浓度的trans-ZT使得枝条的生长速度变慢，诱发的新枝条相对粗壮；而相对高浓度的trans-ZT使得新枝条的生长速度过快(表3)，枝条变细，可利用率下降，所以需综合增值系数和生长情况选择适合的trans-ZT的浓度。此外，不同品种对trans-ZT浓度变化的响应略有不同，其中品种1和2的适宜trans-ZT浓度(2.0 mg·L-1)略高于品种3和4(1.5 mg·L-1)。

表3 不同浓度的trans-ZT对杜鹃枝条增殖系数的影响

2.2.3 生根激素浓度对瓶苗根诱导的影响

研究了3种生根激素及不同浓度对瓶苗生根诱导的影响。结果表明，IBA和NAA诱导生根率都达到了95%以上，而IAA的诱导生根率较低，为40%左右。此外，IBA诱导的根系要比NAA诱导生长的根系更为粗壮(图2)。IBA和NAA的适宜浓度分别为100～150 μg·L-1和50～100 μg·L-1，使瓶苗的生根诱导率达到90%以上。当试验低于此浓度时，根诱导效果较差，当高于此浓度时会使气生根的数量增加，同时也导致枝条的生长受到抑制。

图2 添加100 μg·L-1的不同激素对杜鹃瓶苗生根诱导的影响

3 讨论

本研究以本单位培育的4个映山红杜鹃杂交种的茎段为外植体，在添加不同浓度的trans-ZT的WPM培养基上成功诱导出无菌的幼嫩新枝条；通过进一步的增殖培养，获得了较高繁殖系数并生长粗壮的丛生枝条；最后通过生根诱导，成功获得了大量组培苗。本试验结果为映山红杂交杜鹃外植体组培和无菌扩繁的技术和规模化生产提供技术支撑。

WPM基本培养基是以往研究报道的最适合杜鹃茎段组织培养和无菌扩繁的培养基。现在市场上有合成的WPM固体培养基销售，此类培养基已经添加各种WPM培养基的基本成分，可依据试验要求的用量(如本试验2.47 g·L-1)进行工作液的配制，比传统的母液配置更为简单、快捷。本试验分别采用了国产与进口的WPM固体培养基，整体培养效果与传统的母液配置法相当，甚至在枝条的生长发育方面更显优势，可作为商业化生产使用。

玉米素是一种天然的细胞分裂素，可以有效刺激细胞分化及侧芽的生长。玉米素在结构上有顺、反两种异构体，反式异构体具有更强的生物活性。本试验结果表明，反-玉米素可以有效诱导杜鹃茎段枝条增殖，这与前人的研究结果相符。试验表明，该激素添加的浓度不宜过高，过高会产生畸形腋芽或者玻璃化苗。本试验4个杜鹃品种的最适trans-ZT浓度为1.5～2.0 mg·L-1，其增殖系数可以达到4.1～7.2倍，取得了比较好的繁殖系数和再生苗的质量。

杜鹃是生长比较缓慢的木本植物，其组培苗的生根诱导一直是个难题。本试验选用的3种不定根诱导激素中，IBA和NAA的诱导效果要明显优于IAA。其中100～150 μg·L-1的IBA或50～100 μg·L-1的NAA都可以使组培苗的生根率达到90%以上，而且根系较为发达，移栽成活率高。