石斛抗氧化活性研究进展

侯 帆，邓晓东，钟燕岭，张薇薇*

1成都医学院公共卫生学院，成都 610500；2四川国际旅行卫生保健中心，成都 610041

石斛(Dendrobium)为兰科(Orchidaeae)的一大属，是我国古文献最早有记录的兰科植物之一，可追溯至1500年前的《神农本草经》。石斛同灵芝、人参及冬虫夏草等珍贵药材齐名，主伤中，除痹，下气，补五脏虚劳赢瘦，强阴，久服厚肠胃，轻身延年。现代药理学研究表明石斛具有抗氧化、抗衰老、改善肝功能、治疗白内障、增强人体免疫力、降血糖、抗血栓、抗肿瘤、抗诱变、抗菌、促消化等功能[1]。目前，铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)、金钗石斛(D.nobileLindl.)、鼓槌石斛(D.chrysotoxumLindl.)以及流苏石斛(D.fimbriatumHook.)4种石斛被收录于《中华人民共和国药典》中。此外，《中药大辞典》中收载的石斛有9种，《新华本草纲要》中收录的石斛多达21种。石斛药理作用的发挥同其抗氧化活性相关，研究其抗氧化活性可为由氧化应激引起的衰老、心血管疾病和癌症等疾病的防治提供理论参考，因此石斛抗氧化活性研究成为国内外的研究热点，本文从具有抗氧化活性的石斛种、评价方法、有效成分及其作用机制三方面进行综述，以期为石斛抗氧化活性的后续研究提供最新参考与思路。

1 具有抗氧化活性的石斛种

石斛主要分布于东南亚的热带、亚热带以及大洋洲，种类达1 500余种，我国境内发现的石斛种有76种(包含2个亚种)。统计可知，国内外目前已报道具抗氧化活性的石斛有31种(见表1)，除黄心石斛外其余种均在我国境内有分布。1996年就有报道霍山石斛、细茎石斛以及铁皮石斛具有抗氧化活性。其后，黄石斛、矩唇石斛、叠鞘石斛、鼓槌石斛、金钗石斛、曲轴石斛、玫瑰石斛、兜唇石斛、束花石斛、密花石斛、杯鞘石斛、晶帽石斛、报春石斛、翅梗石斛、长矩石斛、球花石斛、黑毛石斛、流苏石斛、华石斛、齿瓣石斛、大苞鞘石斛、马鞭石斛、美花石斛、龙石斛、可爱石斛、紫瓣石斛、黄心石斛以及棒节石斛等的抗氧化活性功能也逐步被发现。

表1 已证实具抗氧化活性的石斛种Table 1 Dendrobium species with proven antioxidant activity

2 石斛抗氧化活性评价方法

石斛的抗氧化活性研究需要对其展开准确的抗氧化活性评价，因此，选择适宜的抗氧化活性评价方法显得尤为重要。目前主要通过体外实验与体内实验评价石斛抗氧化活性，最常用的体外实验方法有自由基清除能力法、还原能力法、金属离子螯合能力法与细胞模型法，体内实验则以大、小鼠模型，人体模型以及其他模型(如果蝇模型与秀丽线虫模型)等活体生物模型为主。石斛抗氧化活性评价的方法较多，且各有优缺点(见表2)，应用时根据研究目的选择恰当的方法。

表2 石斛抗氧化活性常用评价方法汇总Table 2 Summary of current evaluation methods for the study of antioxidant activity of Dendrobium

续表2(Continued Tab.2)

2.1 体外实验

2.1.1 自由基清除能力法

抗氧化能力与自由基清除能力呈显著正相关，因此体外自由基清除能力法常用于评价物质的抗氧化能力，常用自由基有ABTS自由基、DPPH自由基、羟基自由基与超氧阴离子自由基等。研究发现自由基清除法具有便捷、稳定的优点，但受限于待测物质成分组成、具体结构以及抗氧化机制的差异，运用此法应同时测定物质对多种自由基的清除能力，综合比较，以确保结果的准确性[18]。如Luo等[19]发现金钗石斛水提多糖对ABTS自由基的清除率显著高于羟基自由基与DPPH自由基；而其关于叠鞘石斛多糖抗氧化活性的研究结果则显示高浓度的叠鞘石斛多糖提取物能强力清除DPPH自由基，对ABTS自由基的清除效果则不明显；Paudel等[20]则证实不同溶剂所提细茎石斛提取物对DPPH自由基清除能力不同。因此，在比较铁皮与霍山两种石斛多糖的抗氧化能力时，Zha等[21]综合评价两者对超氧阴离子自由基、羟基自由基与烷基自由基的清除能力后，才得出霍山石斛多糖抗氧化能力更强的结论。

2.1.2 还原能力法

抗氧化剂都是还原剂，因而常用其还原能力来评价抗氧化活性，常见评价指标有铁离子还原能力(FRAP)与铜离子还原能力(CUPRAC)。Hao等[22]通过FRAP法探究霍山石斛多糖的还原能力时发现霍山石斛多糖还原能力一般，但能强力清除H2O2与羟基自由基。提示在物质抗氧化活性的研究中，还原能力法需同自由基清除法联合使用以增加结论的说服力[23]。

2.1.3 金属螯合能力评价法

石斛通过螯合金属离子，抑制金属离子的催化氧化自由基链式反应起到抗氧化作用，因此其对金属离子的螯合能力也可用于抗氧化活性的评价。叠鞘石斛多糖[24]与总黄酮提取液，以及铁皮石斛提取物[25]均能较好的螯合Fe2+，且螯合率均同浓度呈正相关。

2.1.4 细胞模型

人体衰老或病变源于细胞长期处于氧化应激状态，因此利用细胞模型评价物质的抗氧化活性极为常见[26]。细胞模型评价法的关键在于细胞模型的构建，如Zhao等[27]采用Jurkat细胞模型探究鼓槌石斛多糖对羟基自由基的清扫能力，Huang等[28]则通过过氧化氢诱导的RAW264.7巨噬细胞模型证实铁皮石斛有三种多糖具有氧化损伤的修复能力。抗氧化剂能保护衰老小鼠的心肌细胞，对抗氧化与自由基清除能力起到强化作用。有研究利用过氧化氢诱导H9C2心肌细胞氧化应激模型证实铁皮石斛多糖能增强心肌细胞抗氧化性能，显著改善心肌细胞凋亡[29]。Tang等[30]还利用60 mJ/cm2户外紫外线(UVB)照射建立光老化成纤维细胞模型，发现铁皮石斛多糖能清除UVB诱导的活性氧(ROS)，抑制光老化成纤维细胞基质金属蛋白酶1(MMP-1)的分泌，上调转化生长因子-β(TGF-β1)的表达，调节胶原蛋白生成降解平衡，对光老化人皮肤成纤维细胞起到保护作用。

2.2 体内试验

2.2.1 大、小鼠模型

生物体内有内源性抗氧化防御系统，生物模型能更好模拟抗氧化物质的作用环境，再通过体内丙二醛(MDA)、各类抗氧化酶与非酶类抗氧化剂含量作指标来评价抗氧化活性更具参考意义。体内试验中，石斛抗氧化活性评价大多采用大、小鼠模型，大量实验表明石斛能提高血清中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)[32]、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)[2]水平，并降低MDA水平。应用时应根据研究目的选择具体机体氧化损伤小鼠模型：一是小鼠肝损伤模型，包括溴代苯致小鼠实验性肝损伤[5]、酒精性肝损伤[33]、CCl4致肝损伤[34]以及糖尿病致肝损伤[35]等；二是肾损伤模型，其中，肾阴虚小鼠模型[2]较为常用，也有以顺铂治疗引起的中毒性肾损害大鼠模型[36]探究金钗石斛对肾脏氧化应激的改善作用的；三是葡聚糖硫酸钠建立的溃疡性结肠炎小鼠模型[37]；四是D-半乳糖诱导小鼠衰老模型[38]等。

2.2.2 人体模型

人体模型只能用于临床试验中，Yang等[39]便利用铁皮石斛对慢性肝炎患者进行治疗的机会，观察并研究铁皮石斛对慢性肝炎患者免疫与抗氧化状态的调节作用。研究结果显示，铁皮石斛能很好改善慢性肝炎患者外周血T淋巴细胞亚群与抗氧化指标(包括总抗氧化能力(T-AOC)、SOD、MDA及CAT)，促进患者T淋巴细胞的增殖和分化，提高患者的机体组织修复能力，证实铁皮石斛在慢性肝炎患者治疗中通过抗氧化功能起治疗作用。但此模型只可用于药物的临床试验阶段，且需通过伦理委员会同意。

2.2.3 其他模型

果蝇模型体积小，数目大，成本低，被用于石斛抗氧化活性的评价。Qiu[41]利用不同剂量铁皮石斛多糖喂食果蝇，证明铁皮石斛多糖通过调节相关基因提高SOD、CAT等酶的活力，清除果蝇体内的自由基进而延长寿命。此外，具有神经细胞的多细胞生物秀丽线虫也被用于石斛抗氧化活性评价，Gao[42]发现铁皮石斛复方制剂能降低秀丽线虫ROS水平，提高秀丽线虫SOD活力，起到延缓衰老的作用。

3 石斛发挥抗氧化活性的有效成分及其作用机制

石斛的抗氧化活性是体内各种抗氧化活性成分综合作用的结果，其所含的多糖、生物碱、黄酮、植物多酚以及联苄类物质等均具有抗氧化活性，并通过抑制氧化应激与提高机体的抗氧化活性两种机制发挥抗氧化作用。下文将对石斛中主要有效成分及其作用机制进行综述(见表3)。

表3 石斛活性成分的抗氧化作用机制Table 3 Antioxidant mechanism of active ingredients of Dendrobium

续表3(Continued Tab.3)

3.1 多糖

石斛多糖是石斛的重要功能活性物质，以清除自由基的方式抑制氧化应激，又可通过上调Nrf2(neclear factor erythroid 2-related factor 2)/HO-1(血红素加氧酶1)信号通路的蛋白表达提高抗氧化活性[43]。目前，大量抗氧化活性研究围绕石斛多糖展开，其特性已基本明确：第一，石斛种不同,其多糖提取物抗氧化活性不同[10]，如霍山石斛、铁皮石斛、金钗石斛以及鼓槌石斛多糖提取物的抗氧化活性存在显著差异[44]；第二，同种石斛的茎、叶、花对应多糖提取物所具抗氧化活性存在差异，如铁皮石斛花在DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力与FRAP还原能力方面的抗氧化活性评价均显著高于茎叶[45]；第三，同种石斛采用不同溶剂所得多糖提取物具不同抗氧化活性，如金钗石斛水溶性多糖的抗氧化活性高于碱溶性多糖[46]与聚二乙醇(PEG)提多糖[47]，铁皮石斛的碱溶性多糖[48]与酶解多糖[49]抗氧化能力均高于水提多糖。因作为混合物的石斛多糖提取物抗氧化能力取决于多糖组分构成情况，而石斛多糖单体组分的抗氧化活性又同其分子量[50]与分子构型[51]相关，如分子量较大或较小的多糖抗氧化活性更强，叠鞘石斛、紫皮石斛、铁皮石斛这类β构型的酸性多糖清除自由基的活性比金钗、马鞭等α构型的酸性多糖更强[51]。

3.2 生物碱

生物碱是石斛类药材中的一类活性成分，可清除氧化物质以抑制氧化应激，如霍山产铁皮石斛[52]与霍山石斛中分离出生物碱均对羟基自由基有清除能力，但清除能力较低；石斛中的生物碱还可通过激活Nrf2(neclear factor erythroid 2-related factor 2)/ARE(antioxidant response element)信号通路，提高抗氧化活性，如金钗石斛生物碱上调此通路信号能降低CCl4肝损伤模型肝线粒体中MDA，H2O2和8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)的含量，使GSH含量及锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)活性增高[53]。

3.3 植物多酚

植物多酚是一种含有多元酚结构的化合物，具有抗氧化活性的功能，石斛的抗氧化活性与石斛中多酚含量密切相关。石斛的植物多酚可通过清除自由基抑制氧化应激，文献显示金钗石斛[54]、铁皮石斛[55]、鼓槌石斛[56]以及霍山石斛[57]等多酚提取物均有不同程度的自由基清除能力，纯化后的高浓度多酚提取物对ABTS自由基的清除能力接近维生素C(Vc)。美花石斛中的部分石斛多酚具显著的DPPH自由基清除能力，其中3，6，9-三羟基-3，4-二氢蒽-1(2H)-酮与2，4，7-三羟基-9，10-二氢菲等酚类化合物的抗氧化活性比Vc更高[58]，其能提高SOD、CAT、GSH[59]含量，增强GSH-Px[55]的活性，以保护机体不受氧化损伤。

3.4 黄酮

黄酮苷类化合物不仅可以清除活性自由基，终止自由基链反应，螯合起催化作用的金属离子[60]，还能抑制产生自由基的部分酶活性，从而起到抗氧化作用。石斛体外抗氧化性能同其黄酮含量有较强相关性，含黄酮最多的提取物对ABTS与DPPH自由基的清扫能力最强[61]。金钗石斛与铁皮石斛的黄酮均具有抗氧化活性，其中，金钗石斛黄酮苷中芹菜素-6-C-α-鼠李糖-8-C-β-葡萄糖苷具抗氧化性能，且与给药浓度存在显著正相关[62]；铁皮石斛茎、叶、花中的黄酮均具有一定抗氧化活性，花中所含黄酮对自由基的清除效果最好[63]。

3.5 联苄类

联苄类化合物为石斛的生物活性成分之一，抗氧化性是联苄类物质的基本性质，且其体外抗氧化活性随纯度增大而增强。Li等[64]先后从铁皮石斛中分离出8种具一定抗氧化活性的联苄类化合物，其中7种单体能通过清除自由基(DPPH自由基)的方式抑制氧化应激；石斛酚是石斛联苄类物质中的单体成分，能提高细胞中SOD活力与总抗氧化能力(T-AOC)，减少MDA，使细胞具更强抗氧化活性[65]。联苄类物质还能通过抑制NO自由基的生成发挥抗氧化作用[66]，但尚未找到具体遗传机制相关研究。

3.6 其它

石斛还含有其它活性物质，如菲类[67]、芴酮等，且均具有强大的自由基清除能力[68]。如铁皮石斛中花色苷对自由基的清除能力强于Vc[69]，兜唇石斛中一种抗氧化活性多肽能直接参与抗氧化物酶的代谢活动，因其肽序列尾端的络氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)提高对过氧自由基(ROO)的清除能力，增强红细胞的抗氧化活性[70]。

4 结语

石斛所含生物活性成分极为丰富，是潜力巨大的天然抗氧化剂，大量抗氧化活性研究围绕其展开，但还需深入研究。首先在石斛种上的研究集中于铁皮、霍山、金钗、鼓槌等少数分布较广的石斛，其余石斛种缺少研究；其次在石斛抗氧化活性评价方法上集中于自由基清除法、还原能力法与金属螯合能力法的应用，细胞模型与体内试验应用较少，且由于石斛抗氧化活性缺乏权威的评价标准，导致不同种石斛以及不同有效成分的抗氧化活性大小难以比较；最后对石斛抗氧化活性成分研究主要以多糖的提取纯化、结构鉴定及功能活性研究为主，围绕黄酮、酚类、联苄类等抗氧化活性更高的活性物质展开研究较少，尤其缺乏作用机制的研究，对石斛抗氧化活性成分的高级结构鉴定也不深入，且结构鉴定与功能活性研究相对独立，很少有研究将二者联系起来，从其结构上探究其抗氧化活性机制。