基于网络药理学-分子对接研究桑不同入药部位防治糖尿病的作用机制

李德龙，何 韬，陈冰婷，伊丽则热·艾拜杜拉，马晓丽

新疆医科大学药学院，乌鲁木齐 830011

桑科(Moraceae)桑属植物桑(MorusalbaL.)，始载于《神农本草经》[1]，其叶子、果实、枝均可入药，桑叶(Folium Mori，FoM)，性味苦甘寒，归肺肝经，功效：疏风清热，养肺明目，临床上常应用于心脑血管病或脱发的治疗[2]；桑椹(Fructus Mori，FrM)，性味甘寒，归心肾经，补阴补血，生津润肠[3]，被称为“民间圣果”；桑枝(Ramulus Mori，RaM)，性味，苦平，归肝，功效：祛风清热通络，常用于关节炎、风湿的治疗[4]。从性味归经来看，桑叶作用更加广泛，现代医学研究发现桑的不同入药部位中虽然都含有黄酮、生物碱、多酚等功效组分，具有抗氧化、抗炎、降脂、降糖、抗癌、降压等作用[5]，但各入药部位的活性成分含量、药理活性及临床用途并不完全相同。如何客观阐明桑各入药部位活性成分群、预测生物学机制成为了推动桑资源基础物质研究的关键问题。

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一种严重的代谢性疾病，对其有治疗作用的中药开发一直是当今的热点与难点，而网络药理学是一种基于大数据分析的多元方法，能够快速预测中药的“成分-靶点-疾病”网络，解释中药多成分起效的活性物质群，对评价中药的药用价值具有重要作用[6]。Liu等[7]采用网络药理学的方法发现甘草苷主要通过调控PI3K-AKT信号通路、癌症信号通路、Ras信号通路发挥治疗抑郁症和糖尿病的作用。Ge等[8]通过网络药理学研究了桑叶粉末抗糖尿病的作用机制，鉴定并得到22种药物成分，可调节TNF、PPARG、GSK3B、IRS1、IL-6等靶蛋白，它们与胰岛素及炎症信号通路、糖代谢等相关通路、慢性炎症性疾病等有关。本课题组前期采用网络药理学方法预测了桑椹多成分协同防治防治糖尿病的作用机制[9]。

为进一步明确桑不同入药部位的抗糖尿病作用，本文通过网络药理学策略，系统分析各入药部位药性差异及作用机制，对比、解释桑不同部位防治糖尿病的关键药效物质，结合生物信息注释方法对药性差异进行全新阐释，为显著提升桑的药用资源开发领域，促进桑资源对复杂代谢性疾病防治提供全新的研究模式。

1 材料与方法

1.1 桑不同部位活性成分群及其潜在靶点的建立

通过TCMSP、TCMID和BATMAN-TCM等中药数据库中药名称检索及万方、知网文献检索获取桑叶、桑椹、桑枝的化合物成分信息及化合物对应的潜在靶标信息。参考TCMSP数据库中口服生物利用度[10](oral bioavailability，OB≥30%)和类药性(drug-like，DL≥0.18)等中药体内ADME参数对化合物库进行筛选，并将筛选后的活性成分对应的靶点名用Uniprot蛋白数据库进行标准化处理，最终得到三个部位活性成分群及其潜在靶点。

1.2 桑不同部位活性成分-DM靶标网络构建

在OMIM、TTD、GeneCards数据库中以“type 2 diabetes”为检索词，整合得到II型糖尿病靶点信息，与成分靶点取交集，得到不同部位治疗糖尿病的潜在靶点，利用Cytoscape 3.7.2软件分别绘制桑不同部位活性成分-疾病靶点网络图。

1.3 筛选桑不同入药部位的主要活性成分及其差异分析

通过不同入药部位活性成分-疾病靶点的网络筛选主要活性成分，将度值靠前的成分作为各入药部位主要活性成分，并比较其共有成分与差异成分，判断其药性差异的物质基础。

1.4 蛋白-蛋白互作网络(PPI)构建

为了获取与疾病有关的核心基因，我们分别将获得的三个入药部位的潜在作用靶点导入到STRING蛋白数据库，限定物种为人，选取combined score>0.7的靶点作为核心靶点，将结果数据导入到Cytoscape 3.7.2软件中构建PPI网络。

1.5 GO分类富集分析与通路分析

将获得的核心靶点导入到WebGestalt(www.webgestalt.org/#)基因富集分析在线工具中进行多组间GO注释分析与KEGG通路富集分析(FDR<0.05)，比较并分析三个组织部位对2型糖尿病的作用机制。

1.6 分子对接

应用AutoDock vina 软件将三个部位PPI 网络中度值排名前3的5个靶点分别与3个共有成分、8个度值靠前的差异化合物进行分子对接验证，并用临床常用药物二甲双胍(metformin)作为对照。分别从PDB蛋白质结构数据库和ZINC数据库中下载受体的晶体结构和配体的化学结构，MAPK8、AKT1、VEGFA、IL6、PPARG对应的PDB ID分别为3PZE、6S9W、4KZN、1ALU、6MS7，采用AutoDock Tools工具对上述蛋白受体和配体进行常规处理，再用其Autogrid模块得到对接活性位点，运行程序进行分子对接，得到结合能 (affinity)。本研究以结合能< -5.0 kcal/mol为分子与靶点结合性较好的条件。

2 结果

2.1 活性成分的筛选及疾病靶点的获取

通过检索数据库和相关文献并剔除掉没有明显药效的化合物后得到FoM中194个化合物，FrM中72个化合物，RaM中30个化合物，主要分为黄酮类、多糖类、挥发油、生物碱以及氨基酸类等，对三者作韦恩图比较(图1A)，只有5种共有化合物桑黄酮(kuwanon c)、1-脱氧野尻霉素(DNJ)、桑色素(morin)、东莨菪内酯(scopoletin)、肌肉肌醇(myo-inositol)，三个入药部位化合物种类差异明显。根据OB及DL参数筛选并删除一些一物多名的化合物与重复重现的靶标以及一些没有明确对应靶标的化合物后，FoM有45个活性化合物和232个化合物所对应的靶点，FrM中有29个活性化合物和350个化合物所对应的靶点，RaM中有16个活性化合物和153个化合物所对应的靶点，这表明化合物与靶点的差异可能是桑不同入药部位作用差异的原因。在OMIM、TTD、GeneCards数据库中筛选得到II型糖尿病靶点284个，与不同入药部位活性成分作用靶点取交集(图1B)，得到FoM治疗靶点24个(PTGS2、PTGS1、PPARG、F2、DPP4等)，FrM治疗靶点31个(PPARG、PTGS2、PTGS1、NFKB1、TP53等)，RaM治疗靶点22个(PTGS2、PTGS1、MGAM、DPP4、F2等)，三者共有的治疗靶点13个(MGAM、PIK3CG、DPP4、PPARG、TP53等)。

图1 三个入药部位整体化合物Venn图(A)与ADME筛选后化合物靶点与疾病靶点Venn图(B)Fig.1 Venn’s diagram of all compounds (A) and compound target-disease target after ADME screening (B) in three parts of M.alba

2.2 桑不同部位活性成分-DM靶标进行网络构建

将三个入药部位的活性化合物靶标与疾病靶标映射后作活性成分-疾病靶点网络图(图2～4)，FoM生成62个节点，136条边；FrM生成46个节点，57条边；RaM生成37个节点，65条边，节点大小和颜色表示该节点自由度值的大小，节点越大，由绿色变红色对应的度值越大。其中FoM中度值较大的成分及度值为槲皮素(quercetin，16)、山奈酚(kaempferol，15)、甲基丁香酚(mthyleugenol，5)、丁香酚(eugenol，5)等，度值较大的靶点及度值为环氧合酶2(PTGS2，31)、环氧合酶1(PTGS1，24)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG，15)、凝血酶原(F2，13)等；FrM中度值较大的成分及度值为槲皮素(quercetin，14)、反式白藜芦醇(trans resveratrol，9)、甲酸(FMT，6)、杨梅素(myricetin，5)等，度值较大的靶点及度值为过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG，6)、环氧合酶2(PTGS2，5)、环氧合酶1(PTGS1，4)、DNA结合因子KBF1(NFKB1，3)等；RaM中度值较大的成分及度值为有山奈酚(kaempferol，15)、苦来西碱(cularicine，9)、桑色素(morin，6)、二氢山奈酚(dihydokaempferol，6)等，度值较大的靶点及度值为环氧合酶2(PTGS2，10)、环氧合酶1(PTGS1，9)、麦芽糖淀粉酶(MGAM，8)、二肽酰肽酶IV(DPP4，8)等，这些化合物和靶点可能是桑源药材干预糖尿病的主要化合物与靶点。三者13种共有靶点中PTGS1、PTGS2、PPARG、F2、DPP4均度值靠前，但是PIK3CG只在FoM中度值靠前，TP53只在FrM中度值靠前，MGAM只在RaM中度值靠前；另外，FoM中没有独有靶点，FrM中13种独有靶点中NFKB1度值靠前，RaM中3种独有靶点中没有度值靠前的靶点。这些主要化合物与靶点的差异也进一步提示不同入药部位防治糖尿病作用机制的不同。

图2 FoM化合物-DM疾病靶点网络图Fig.2 Network of FoM ingredients-disease target

2.3 筛选桑不同入药部位的主要活性成分及其差异分析

将各部位成分-疾病靶点网络图中的化合物进行整理，得到FoM中有38个成分，FrM中有15个成分；RaM中有15个成分，将三部位成分进行韦恩分析，见表1，并结合各部位成分-疾病靶点网络图分析其度值，发现三部位中共有的主要成分有3个：桑色素、东莨菪内酯、1-脱氧野尻霉素。桑色素是RaM中度值较高的成分；FoM中的特有成分有26个，其中丁香酚和甲基丁香酚是其度值较高的成分；FrM中的特有成分有6个，其中反式白藜芦醇与杨梅素是其度值较大的成分；RaM中的特有成分有9个，其中苦来西碱与二氢山奈酚是其度值较大的成分。两两比较中，FoM与FrM共有成分为9个，槲皮素为两者中高度值的成分，FoM与RaM共有成分为6个，其中山奈酚为两者中高度值的成分。有趣的是FrM与RaM都有15个主要成分，但共有成分仅有3个常见成分，从三部位个差异成分的个数比较得出，FoM分别与FrM和RaM在防治糖尿病方面可能具有相似的作用，FrM与RaM在防治糖尿病方面可能作用的途径差异较大。

图3 FrM化合物-DM疾病靶点网络图Fig.3 Network of FrM ingredients-disease target

图4 RaM化合物-DM疾病靶点网络图Fig.4 Network of RaM ingredients-disease target

表1 三个入药部位活性成分差异Table 1 Different active components of three parts used in medicine

2.4 蛋白-蛋白互作网络(PPI)构建

将STRING数据库中按照结合分数(combined score)> 0.7筛选后的核心靶点相互作用关系导入到Cytoscape 3.7.2软件中分别构建三个部位PPI核心网络(图5)，边越粗结合分数越大，节点越大表明度值越大，FoM中共有22个节点，74条边，其中胰岛素(INS，14)、促分裂原活化蛋白激酶8(MAPK8，12)、α丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶(AKT1，12)靶点度值排名靠前；FrM中共有26个节点，80条边，其中

图5 三部位PPI网络图Fig.5 PPI network of three parts注：A：FoM；B：FrM；C：RaM。

胰岛素(INS，14)、α丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶(AKT1，14)、血管内皮生长因子A(VEGFA，13)靶点度值排名靠前；RaM中共有16个节点，40条边，其中度值排名靠前的靶点有白细胞介素-6(IL6，9)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG，8)、α丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶(AKT1，8)。三个入药部位共涉及32个核心靶点，这些度值排名靠前的靶点可能是与糖尿病有关的关键靶点。

图6 三个入药部位GO富集分析柱状图Fig.6 Column diagram of go enrichment analysis in three parts注：A：FoM；B：FrM；C：RaM。

2.5 GO分类富集分析与通路分析

2.5.1 GO富集分析

将获得的三个部位的核心靶点导入WebGestalt在线工具中进行GO分析(FDR<0.05)：生物过程(BP)、细胞组分(CC)和分子功能(MF)。发现FoM中与BP相关的条目有细胞对含氧化合物的反应、急性炎症反应调节、细胞对有机氮化合物的反应、细胞增殖调控、细胞凋亡调节、代谢过程调节、细胞对胰岛素刺激的反应等993条；CC相关条目有膜筏、内质网、细胞表面等13条；MF相关条目有信号受体结合、蛋白磷酸酶2A结合、相同蛋白结合、胰岛素样生长因子受体结合等33条。FrM中与BP相关条目有细胞增殖调控、细胞对含氧化合物的反应、凋亡过程调控、转运调控、急性炎症反应调节、脂质代谢过程的调控、氧化应激反应等983条；CC相关条目有内质网腔、分泌颗粒、分泌囊泡等8条；MF相关条目有相同蛋白结合、信号受体结合、蛋白质二聚活性、脂肪酸结合、胰岛素样生长因子受体结合等66条。RaM中与BP相关条目有活性氧代谢过程的正调节、急性炎症反应的调节、细胞对含氧化合物反应、细胞凋亡调节、对有机氮化合物反应、细胞增殖等886条；CC相关条目有膜微域、内质网、转移含磷基团的转移酶复合物等12条；MF相关条目有信号受体结合、蛋白质磷酸酶结合、受体配体活性、抗氧化活性等36条。将本体条目按注释到的基因数目进行功能分类做柱状图(图7A～C)，可以看到涉及多个生物过程，其中所有靶点都与代谢过程有关，而糖尿病又是代谢紊乱的疾病，桑的三个入药部位有可能主要干预代谢过程发挥治疗糖尿病的作用，对三者BP进行比较分析发现其都涉及细胞对含氧化合物的反应、急性炎症反应调节、细胞对有机氮化合物的反应、细胞增殖调控、细胞凋亡调节等生物过程，三者中尤以桑叶靶点功能最多(993条)，桑椹其次(983条)，桑枝最少(886条)，此结果可能表明调节代谢过程能力：桑叶>桑椹>桑枝。

图7 分子对接的3D和2D模式图Fig.1 3D and 2D pattern diagrams of molecular docking注：A：苦来西碱-MAPK8；B：苦来西碱-AKT1；C：二氢山奈酚-VEGFA；D：苦来西碱-IL6；E：槲皮素-PPARG。Note:A:Cularicine-MAPK8;B:Cularicine-AKT1;C:Dihydrokaempferol-VEGFA;D:Cularicine-IL6;E:quercetin-PPARG.

2.5.2 通路分析

利用WebGestalt在线工具对三个入药部位治疗DM的核心靶点进行KEGG通路富集分析(FDR<0.05)，FoM靶点有83条通路，FrM有80条，RaM有93条。分别选取FDR值排名前20的通路，见表2～4，通路富集分析结果表明三个入药部位的作用通路主要涉及疾病通路、炎症与免疫相关通路等。FoM中与疾病有关的通路有胰岛素抵抗、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、流体剪应力与动脉粥样硬化、II型糖尿病、胰岛素信号通路癌症等；炎症与免疫相关通路主要有脂肪细胞脂肪分解的调节、C型凝集素受体信号通路、TNF信号通路、MAPK信号通路、FoxO信号通路、IL-17信号通路、PI3K-Akt信号通路等。FrM中与疾病有关的通路有流体剪应力与动脉粥样硬化、前列腺癌、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、癌症、胰岛素抵抗；免疫与炎症相关通路有脂肪细胞脂肪分解的调节、PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路、AMPK信号通路、MAPK信号通路、IL-17信号通路、血管内皮生长因子信号通路等。RaM中与疾病有关的通路有胰岛素抵抗、非酒精性脂肪性肝病、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、II型糖尿病、胰岛素信号通路、乙肝等；免疫与炎症相关通路有C型凝集素受体信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路、Toll样受体信号通路、AMPK信号通路、PI3K-Akt信号通路等。三个入药部位通路富集分析都有糖尿病及其并发症通路与大量的炎症通路，可以看出糖尿病与炎症具有密不可分的关系[11]。

表2 FoM治疗靶点KEGG通路富集分析Table 2 Enrichment analysis of KEGG pathway in FoM therapy target

续表2(Continued Tab.2)

表3 FrM治疗靶点KEGG通路富集分析Table 3 Enrichment analysis of KEGG pathway in FrM therapy target

表4 RaM治疗靶点KEGG通路富集分析Table 4 Enrichment analysis of KEGG pathway in RaM therapy target

续表4(Continued Tab.4)

2.6 分子对接

将三个部位PPI 网络中度值排名前3的5个靶点蛋白MAPK8、AKT1、VEGFA、IL6、PPARG分别与metformin、3个共有成分(A)和度值靠前的8个差异化合物(B)进行分子对接验证，结果见表5。若结合能<0，表明配体分子均能和受体蛋白能自发地结合，结合能<-5.0 kcal/mol，表明其结合良好，结合能越小结合性越好。表中70%成分能与靶点蛋白较好地结合，且90%的成分结合性均好于对照药。与5个靶点最佳的分子对接如图8，其中苦来西碱与AKT1结合最好为-10.9 kcal/mol，苦来西碱(cularicine)与AKT1活性位点氨基酸残基ASP292是形成π-阴离子相互作用、与 TRP80形成π-π堆积作用等非键相互作用。结果表明，这12 种成分与靶点蛋白结合性能较好。

表5 三部位差异化合物与核心靶点分子对接结果Table 5 Results of molecular docking between differentially active compounds and target proteins

3 讨论

糖尿病是一种发病率高，危害性大的代谢性疾病，有研究表明[11]糖尿病的发生发展与炎症具有密切的关系，本研究也发现桑治疗糖尿病的潜在靶点VEGFA、IL6、MAPK8、TNF、TP53等与炎症通路有关。

桑叶，性味苦甘寒，归肺肝经[2]；桑椹，性味甘寒，归心肾经[3]；桑枝，性味，苦平，归肝[4]。从桑各部位性味归经来看，桑叶作用更加广泛，桑椹与与桑枝作用差异较大。通过化合物-疾病靶点网络表明桑的不同入药部位防治糖尿病的化合物种类及其作用靶点具有明显差异，从三部位差异化合物的个数比较得出，FoM分别与FrM和RaM在防治糖尿病方面可能具有相似的作用，FrM与RaM在防治糖尿病方面可能作用的途径差异较大，这与各部位性味归经相符。三个入药部位中桑色素、东莨菪内酯、1-脱氧野尻霉素3种为共有化合物，丁香酚、甲基丁香酚、反式白藜芦醇、杨梅素、苦来西碱、二氢山奈酚、槲皮素、山奈酚8种为度值靠前的差异化合物。有研究表明[12]桑色素是一种PTP1B的非竞争性抑制剂，能起到胰岛素增敏的作用，还能通过抗氧化与抗炎作用对胰岛细胞起保护作用[13]；东莨菪内酯是一种天然植物抗毒素，Jang等[14]发现东莨菪内酯通过激活3T3-L1脂肪细胞的PI3K和AMPK途径，促进GLUT4易位到PM，从而促进葡萄糖摄取，具有抗糖尿病作用。1-脱氧野尻霉素是从桑中发现的一种重要生物碱，对α-葡萄糖苷酶具有抑制作用，并可以促进糖酵解，抑制糖的异生，降低胆固醇合成，还能抑制胰岛素的分泌，改善胰岛素抵抗的作用[15]。甲基丁香酚是一种是丁香酚的衍生物，具有镇痛抗炎与抗氧化应激的作用[16]。反式白藜芦醇能通过激活细胞内的SIRT1和AMPK通路缓解胰岛素抵抗，保护胰岛B细胞功能[17]。杨梅素具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗菌和镇痛等药理活性，它还具有抗糖尿病的作用，对人胰岛淀粉样多肽(HIAPP)诱导的胰腺β-细胞的细胞毒性和胰岛功能的恢复有保护作用[18]。苦来西碱是RaM中特有成分，并且与AKT1、MAPK8、IL6分子对接得分较高，目前还未见报道其药理作用，其对AKT1的高结合性有待进一步的实验验证。山奈酚通过抑制肝脏糖异生和提高肝脏胰岛素敏感性来改善肥胖小鼠的高血糖[19]。桑的各部位的主要活性成分在改善糖尿病方面具有多种功效、为桑的不同部位防治糖尿病的活性成分群及其作用机制的研究奠定了理论基础。

PPI网络中桑的三个部位按度值排名靠前的靶点有MAPK8、AKT1、VEGFA、IL6、PPARG。在分子对接中12种成分都能与这些靶点较好结合。VEGF是一种与肝素结合的同型二聚体蛋白，在生理和病理条件下调节血管生成和血管通透性，有研究表明[20]VEGFA的表达与糖尿病具有相关性。MAPK8是MAP激酶家族的成员。MAP激酶是多种生化信号的整合点参与，细胞的增殖、分化、转录调控和发育等多种过程。这种激酶被各种细胞刺激物激活，并针对特定的转录因子，从而介导细胞刺激后的早期基因表达。Guo等[21]采用Gene-ChipTM miRNA 4.0 Array筛选糖尿病人外周血血清发现MAPK8等7个基因可能与2型糖尿病胰岛素抵抗有关。AKT1调控着许多过程，包括新陈代谢、增殖、细胞存活、生长和血管生成，并且AKT1基因多态性与代谢综合征风险相关[22]。IL6是一种重要的炎症因子，参与多种免疫反应，其在糖尿病病人中有显著升高[23]。PPARG控制着脂肪酸的过氧化物酶体β氧化途径，是脂肪细胞分化和葡萄糖稳态的关键调节因子，其表达量与2型糖尿病的风险有关[24]。这些结果与分子对接结果表明MAPK8、AKT1、VEGFA、IL6、PPARG这5个靶点可能是桑源药材治疗糖尿病的关键靶点。

从KEGG富集结果分析可知，桑的三种入药部位主要从炎症与免疫相关信号通路发挥治疗糖尿病的作用，包括白介素-17信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、PI3K-AKT信号通路和MAPK信号通路等。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶(Akt)通过介导生长因子信号在生物体生长、葡萄糖稳态、脂质代谢等方面起着重要作用，是胰岛素信号转导的主要途径，是调控血糖的主要信号通路，PI3K/Akt信号通路异常是糖尿病发生的重要原因[25]。IL-17是一种促炎性细胞因子。在糖尿病的发展中，p38MAPK与肾组织损伤密切相关。一方面，高血糖、血流动力学异常、氧化应激以及前炎症因子等多种因素可以在上游诱导p38MAPK信号通路激活， 另一方面，活化的p38MAPK信号通路可以通过诱导下游炎症细胞活化，促进炎症介质表达，干预细胞因子产生等途径而导致肾组织炎症性损伤[26]。研究结果表明，显著富集的信号通路中也存在着部分调控其他疾病的通路，例如前列腺癌信号通路、非酒精性脂肪肝信号通路、动脉粥样硬化信号通路等。表明机体代谢是相互关联的，药桑可以通过作用于全身其他系统发挥间接治疗糖尿病的作用。

总之，本研究首次应用网络药理学思路与方法揭示了桑的不同入药部位防治糖尿病的成分群及其作用机制，为研究同源异效的中药资源提供了新的思路，为合理利用桑资源提供了理论参考。