基于网络药理学的四君子汤治疗阿尔茨海默病作用机制研究

张运辉，周小青，伍大华，杨梦琳，郑彩杏，童天昊

1湖南中医药大学；22011数字中医药协同创新，长沙 410208；3重庆三峡医药高等专科学校中医学院，重庆 404120；4湖南省中医药研究院附属医院，长沙 410006

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是最常见的痴呆类型，起病潜隐，以严重的认知和记忆功能减退，并伴有进行性的智能、记忆、言语、视空间技能障碍及精神人格改变等主要表现的神经系统退行性病变[1]。目前，西医对AD病因及发病机制仍未完全阐明，尚无根治AD的药物，成为公共健康和医疗界的挑战之一[2]。我国传统中医通过辨病与辨证相结合，抓住AD病因病机特点，随证加减用药，在改善AD患者学习记忆等认知功能、提高生活和社会交往能力方面具有较确切的疗效[3]。

Song[4]认为，脾胃为后天之本，气血生化之源。年老体迈者，脾胃虚弱，水谷精微不能化为精血，肾精空虚，脑髓失充则发为痴呆之证。Lu[5]认为脾胃虚弱是AD的根本原因，由虚而致痰浊血瘀，痰瘀阻塞清窍，加速AD形成。提出“从脾胃论治”AD，并发现健脾方药对AD有一定的治疗作用。四君子汤是经典补脾方药，始载于《太平惠民和剂局方》，由人参、白术、茯苓、甘草组成。其中人参性甘温，益气补脾，为君；白术苦温，健脾燥湿，合人参以益气健脾，为臣;茯苓甘淡，渗湿健脾，为佐；炙甘草甘平，和中益土，为使。四味皆为平和之品，四药相辅，共奏益气健脾之功，为治脾胃气虚的基本方。实验研究表明，四君子汤水提液能提高Aβ25-35诱导的HBMEC损伤细胞的活性，调控GLUT1、LRP1、RAGE mRNA和LRP1蛋白、RAGE蛋白的表达，有助于Aβ跨血脑屏障转运，减少Aβ在脑内的聚集[6]；四君子汤可能通过补脾作用，促进AD大鼠中枢能量生成，改善中枢的能量代谢紊乱，调节线粒体复合体活性及AMPK表达[7]。临床研究发现[8]，四君子汤合黄连解毒汤治疗阿尔茨海默病疗效显著。因此，深入探讨四君子汤的作用靶点及相关信号通路，分析其对AD的影响及其作用机制，对于阐述四君子汤治疗AD的科学内涵以及为AD的临床治疗提供有价值的信息。

由于生物信息学的迅速发展，网络药理学方法已成为一种系统、高效地揭示中药复方分子机制的新手段。网络药理学主要研究药物、靶标和疾病之间的关系，可通过整合中药化学成分、疾病靶标构建“化学成分-作用靶标-疾病靶标-蛋白质相互作用网络”，将相互作用关系可视化为网络模型，并从分子层面和整体的角度研究药物对生物网络的影响[9]，其研究策略的系统性、整体性特点与中医基础理论从整体观念、辨证论治的角度去诊治疾病的理念，中药及方剂的多成分、多靶点、多途径协同作用的原理非常契合[10]。因此，本研究借助网络药理学方法，探讨四君子汤治疗AD的可能作用机制，以期为四君子汤的深入研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 四君子汤有效成分及其靶点的筛选

以“人参”、“白术”、“茯苓”、“甘草”为关键词，从TCMSP数据库(中药系统药理学分析平台，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)查询人参、白术、茯苓、甘草四味中药的有效成分，本研究基于ADME(药物吸收、分布、代谢、排泄)参数进行筛选，对人参、白术、茯苓、甘草的有效成分根据口服利用度(oral bioavailability OB)和类药性(drug- like，DL)筛选出符合条件的候选活性成分及其对应靶点，并设置OB≥30%及DL≥0.18作为筛选条件[11]，筛选出人参、白术、茯苓、甘草的有效成分。通过筛选，559个化合物分子中有136个符合条件，并将其作为候选化合物。为了提供更准确的结果，本研究只选择TCMSP数据库中OB≥33%及DL≥0.19作为有效成分，一共筛选出24个活性化合物。最后，使用Uniprot 数据库并借助Perl 语言，将靶点的“蛋白名(protein name)”统一转换为“基因名(genename)”，得到的信息用于后续的网络药理学数据分析。

1.2 AD疾病相关基因的筛选

通过治疗靶点数据库Drugbank (https://www.drugbank.ca/)、Dis Ge NET(http:// www.disgenet.org/)和TTD(https://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)对AD相关的基因进行筛选，将四君子汤预测的相关靶点网络映射到AD相关靶点网络中，2个网络中重叠的基因即被认为是四君子汤中药成分治疗AD的作用靶点。

1.3 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络构建

将四君子汤预测的相关靶点网络映射到AD相关靶点网络中，2个网络中交集基因即被认为是四君子汤中药成分治疗AD的作用靶点。将四君子汤有效成分与AD的交集基因导入到STRING数据库，选择物种为“Homo sapiens”(人源)进行操作，最小相互作用阀值设为“medium confidence=0.4”，得到蛋白互作PPI网络，即“四君子汤-靶点-阿尔茨海默病”网络。

1.4 关键靶点的筛选

应用Cytoscape 3.7.1软件对PPI网络进行拓扑属性分析，计算PPI网络整体的中介中心性(betweenness centrality，BC)、接近中心性(closeness centrality，CC)和点度中心性(degree centrality，DC)，以betweenness、closeness和degree的均数为“阈值”，选取betweenness、closeness和degree同时在阈值之上的靶点为“关键靶点”，明确PPI网络中的关键靶点。

1.5 关键靶点的代谢通路与生物过程分析

为进一步研究四君子汤抗AD的作用情况，采用Metascape平台对四君子汤的AD靶点群进行KEGG代谢通路富集分析，研究四君子汤靶点的主要抗AD代谢通路；再进行GO生物过程富集分析，诠释四君子汤靶点的抗AD生物过程，Metascape的平台列表与背景均选择“Homo Sapiens”(人源)进行操作。筛选出AD与四君子汤有效成分相关性前20的分子功能和前10的信号通路。

1.6 网络构建

将四君子汤有效成分、对应靶点导入Cytoscape3.7.1构建四君子汤-有效成分-基因靶点网络。

1.7 体外验证实验

1.7.1 细胞与试剂

大鼠肾上腺髓质嗜络细胞瘤细胞株PC12细胞(长沙赢润生物技术有限公司)；Aβ25-35(购自美国Sigma公司)；TB Green Premix Ex Taq PCR试剂盒(TAKARA公司)；DMEM细胞培养液(北京默飞世尔生物化学制品有限公司)；10%新生小牛血清(Hyclone Lab)；PBS(北京索莱宝科技有限公司)；FBS(吉泰远成生物科技有限公司)。四君子汤1剂购自湖南中医药大学第一附属医院，经水提、蒸发、浓缩至不流动的清膏，使用时称取适量，溶解，过 0.22 μm 滤膜除菌后于-20 ℃保存。

1.7.2 细胞培养及分组干预

PC12细胞培养于DMEM培养基(含10%FBS、1%PBS)，37 ℃、5%CO2培养箱培养，细胞贴壁后取对数生长期细胞，分为5组。对照组：加入不含FBS、PBS DMEM中孵育24 h；模型组：予Aβ25-35(20 μmol/L)孵育24 h[12]；四君子汤低剂量组(1 mg/mL)、中剂量组(2 mg/mL)、高剂量组(4 mg/mL)孵育24 h。

1.7.3 QPCR检测PC12细胞培养上清APP、Caspase-3、Bax、Bcl-2、mTOR、MAOB、INSR mRNA表达

Trizol法提取PC12细胞总mRNA，逆转录合成c DNA。使用Primer-BLAST设计引物序列(见表1)。反应条件为95 ℃ 3 min→95 ℃ 5 s → 60 ℃ 1 min，重复40个循环；按95 ℃ 15 s→55 ℃ 1 min→95 ℃ 30 s反应条件测溶解曲线。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法分析基因表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.7.4 统计学处理

2 结果

2.1 四君子汤有效成分的筛选和靶标预测及分析

为了提供更准确的结果，本研究选择TCMSP数据库中OB≥33%及DL≥0.19作为有效成分，一共筛选出24个活性化合物(如表2)。其中人参有效成分9个、白术有效成分3个、茯苓有效成分6个、甘草有效成分6个。其中人参皂苷Rh2、人参二醇、茯苓多糖、异甘草素等在活性成分中占主要比例。对四君子汤候选靶标进行基因分析，取P值排名前 20位，得到候选靶标的基因功能，涉及抗凋亡、抗炎、对β淀粉样蛋白(β-amyloid precursor protein,APP)的反应、对氧化应激反应的调节、对自噬的调控、老化、记忆、对胰岛素的反应、氧化还原过程等。对四君子汤候选靶标进行通路富集分析，取P值排名前20位，得到候选靶标参与的通路信息，主要涉及凋亡、阿尔茨海默病、炎症反应、自噬、胰岛素代谢等通路。

表2 四君子汤有效成分Table 2 Effective ingredients of Sijunzi Decoction

2.2 有效成分-基因靶点网络的构建

将筛选后四君子汤的28个有效成分及166个相关靶点导入 Cytoscape 3.7.1构建“四君子汤有效成分-基因靶点网络”(见图1)。24个菱形表示四君子汤的有效成分，164个绿色三角形为有效成分作用靶点，共有898条边代表靶点和有效成分之间的相互作用，体现了四君子汤多成分、多靶点的特点。

图1 四君子汤有效成分-基因靶点网络Fig.1 Effective ingredients of Sijunzi Decoction-gene target network注：蓝色菱形：人参活性成分；红色菱形：白术活性成分；黄色菱形：茯苓活性成分；紫色菱形：甘草活性成分；绿色三角：靶基因。Note:Blue diamond:Active compound of Ginseng Radix et Rhizoma;Red diamond:Active compound of Atractylodis Macrocephalae Rhizoma;Yellow diamond:Active compound of Poria cocos;Purple diamond:Active compound of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma;Green triangle:Target gene.

2.3 阿尔茨海默病相关基因

在Drugbank、Dis Ge NET和TTD数据库检索AD的靶基因，去重后共得到2 245个基因。

2.4 蛋白互作网络构建图

在Drugbank、Dis Ge NET和TTD数据库检索AD的靶基因与四君子汤作用的靶基因有102个重复，这102个靶基因可能为四君子汤抗AD的靶点。为研究各靶点在体内的相互作用关系，寻找核靶点，将潜在靶点蛋白群进行PPI网络分析(见图2)，结果共发现102个靶蛋白发生相互作用，产生722条代表蛋白之间相互作用的边。其中疾病靶标主要有PSEN1(早老素1)、PSEN2(早老素2)、APOE(载脂蛋白E)、APP(淀粉样β前体蛋白)等，药物靶标主要有CASP3(半胱天冬酶3)、Bax(凋亡调节剂Bax)、Bcl-2(凋亡调节剂Bcl-2)、mTOR(丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶mTOR)、MAPK1(丝裂原激活的蛋白激酶1)、MAOB(单胺氧化酶B)、CDK5(细胞周期蛋白依赖性激酶-5)、GSK-3β(糖原合酶激酶3β)、INSR(胰岛素受体)，这些药物靶标主要涉及细胞凋亡、炎症反应、氧化应激反应、自噬、胰岛素代谢等。

图2 靶蛋白 PPI 网络图Fig.2 PPI network diagram of target protein

2.5 核心靶点分析结果

Cytoscape 3.7.1计算得到，PPI网络平均度值为14.2，平均介数为3.6×10-2，平均紧密度为0.5，度值、介数和紧密度均超过平均值的靶蛋白共7个，依次为APP、Caspase-3、Bax、Bcl-2、mTOR、MAOB、INSR，说明以上7个靶点在PPI网络中处于键位置，很可能是四君子汤抗AD的关键靶点。

2.6 Metascape分析的KEGG和GO结果

通过GO数据库分析，四君子汤有效成分靶标与AD疾病靶标基因功能有神经元凋亡过程、对β淀粉样蛋白的反应、炎症反应、氧化应激反应、老化、记忆、神经元凋亡过程的正调控、对氧化应激反应的调节、自噬、对胰岛素的反应、细胞对胰岛素刺激的反应、MAPK级联反应、自噬的调控、神经系统发育等条目(见图3)。说明四君子汤治疗AD的机制可能与调控细胞凋亡、淀粉样β蛋白聚集、炎症反应、氧化应激反应、自噬、胰岛素代谢等密切相关。

图3 有效组分-基因靶点-分子功能的GO富集气泡图Fig.3 Bubble chart of GO enrichment of effective components-gene targets-molecular functions

通过KEGG数据库富集四君子汤治疗AD关键靶标所参与的通路主要涉及凋亡、阿尔茨海默病、MAPK信号通路、mTOR信号通路、NF-κB信号通路、Wnt信号通路、IL-17信号通路、PI3K-Akt信号通路、Notch信号通路、胰岛素信号通路等(见图4)，说明四君子汤可能主要通过调控细胞凋亡、炎症反应、自噬、胰岛素代谢等来防治AD。

图4 前10个代表性的通路Fig.4 Top 10 representative pathways

2.7 四君子汤对 Aβ25-35诱导的 PC12细胞APP、Caspase-3、Bax、Bcl-2、MAOB、mTOR、INSR mRNA的影响

Aβ25-35作用24 h，Bcl-2表达下调(P<0.01)，APP、Caspase-3、Bax、MAOB、mTOR、INSR表达上调(P<0.01)，表明 Aβ25-35可诱导活化各基因；四君子汤干预后，四君子汤中、高剂量组Bcl-2 mRNA表达显著升高(P<0.05，P<0.01)，APP、Caspase-3、Bax、MAOB、mTOR、INSR表达明显降低(P<0.05，P<0.01)(见表3)。

表3 PC12细胞APP、Caspase-3、Bax、Bcl-2、MAOB、mTOR、INSR mRNA表达比较Table 3 Comparison of APP,Caspase-3,Bax,Bcl-2,MAOB,mTOR,INSR mRNA expression in PC12 cells

3 讨论

AD属于中医学“健忘”“痴呆”“呆证”等范畴，脾胃在AD发病中具有重要的作用。脾胃为后天之本，气血生化之源，脾胃能将化生的水谷精微运化至脑，以充养脑髓。Xia[13]认为脾胃运化功能旺盛，水谷精微化生有源，才能充血生精。脾胃虚弱，运化无力，则气血津液化源不足，脏腑亏虚，后天之精来源匮乏，致肾精虚损，脑髓空虚，神机失用,发生痴呆。Zhang[14]指出脾胃亏虚，后天失养，一则肾精不足，不能充养脑髓；二则津液不足，无以内渗于骨空，而髓减脑消，发生痴呆。四君子汤始载于《太平惠民和剂局方》，为治脾胃气虚的基本方。实验研究表明，四君子汤水提液能提高Aβ25-35诱导的 HBMEC 损伤细胞的活性，调控GLUT1、LRP1、RAGE mRNA和LRP1蛋白、RAGE蛋白的表达，有助于Aβ跨血脑屏障转运，减少Aβ在脑内的聚集[6]；四君子汤可能通过补脾作用，促进AD大鼠中枢能量生成，改善中枢的能量代谢紊乱，调节线粒体复合体活性及AMPK表达[7]。临床研究发现[8]，四君子汤合黄连解毒汤治疗阿尔茨海默病疗效显著。

本研究通过中医药整合药理学研究平台收集四君子汤中4味中药有效成分和靶标，结果显示：每味中药可作用于多个靶标，多种中药可同时作用于一个靶点，说明药物间发挥作用有着密切的关系，各药相须相使相辅相成。对基因功能和通路富集的分析显示，四君子汤对 AD的干预作用主要涉及细胞凋亡、淀粉样β蛋白聚集、炎症反应、氧化应激反应、自噬、胰岛素代谢等。通过构建四君子汤潜在药物靶标与疾病靶标相互作用网络，筛选出关键靶标7个，其中疾病靶标主要有PSEN1、PSEN2、APOE、APP等，药物靶标主要有APP、CASP3、Bax、Bcl-2、mTOR、MAPK1、MAOB、CDK5、GSK-3β、INSR。构建疾病靶标与有效成分的网络，共有24种有效成分，四君子汤中与疾病靶标关系密切的有效成分主要为人参皂苷Rh2、人参二醇、茯苓多糖、异甘草素等。Cai[15]研究表明，人参皂苷Rh2能够抑制Aβ25-35激活的BV-2细胞内前炎症细胞因子表达，减轻炎症反应，并进一步抑制氧化应激反应，从而减轻对神经元的损伤，在AD发病中具有保护作用。Liang等[16]研究发现，人参二醇可提高AD细胞模型的存活率，抑制乳酸脱氢酶(LDH)的释放，且能显著抑制细胞凋亡，减轻内Ca2 +超载。Hou等[17]研究发现茯苓多糖能增强超氧化物歧化酶的活性，降低丙二醛的含量，均有利于生物体内自由基的清除，起到延缓衰老的作用。Li[18]研究发现异甘草素对Aβ25-35处理PC12细胞毒性及细胞凋亡有较好的保护作用。

采用四君子汤干预Aβ25-35诱导的PC12细胞模型验证网络药理学研究结果，发现四君子汤可显著上调Bcl-2表达，下调APP、Caspase-3、Bax、MAOB、mTOR、INSR表达。Aβ的异常沉淀是APP过度表达的后果[19]。Caspase-3是Caspases级联反应中下行的最关键的凋亡执行蛋白酶，在各种程序启动的细胞凋亡中起最后枢纽的作用[20]，是细胞凋亡的关键标志因子，有人称之为“死亡蛋白酶”。研究表明，AD脑内神经元的丢失机制与细胞凋亡密切相关，海马神经元凋亡是受各种基因调控的程序化死亡过程，其病理生理机制十分复杂，在凋亡发生机制中最关键的环节之一是Bc1-2和Bax对细胞凋亡的调控[21]。MAOB基因的异常表达或突变与AD的发生具有密切关系[22]。MAOB 活性下降有利于保持神经系统的正常功能，对机体的抗氧化及抗衰老有促进作用[23]。mTOR的活性是自噬体形成、成熟的关键[24]。Liu等[25]研究发现，在AD细胞模型中的INSR基因和蛋白水平均升高。四君子汤可上调Bcl-2表达，下调APP、Caspase-3、Bax、MAOB、mTOR、INSR表达，与预测其参与调控β淀粉样蛋白聚集、细胞凋亡、氧化应激反应、自噬、胰岛素代谢相吻合。故体外验证实验在一定程度上证实了网络药理学预测结果。

本研究基于网络药理学技术，采用整合药理学平台，建立了四君子汤成分-基因靶标的分子生物网络、蛋白与蛋白相互作用网络，从多个角度探索四君子汤治疗AD的潜在分子机制。结果表明，四君子汤可通过调控β淀粉样蛋白聚集、细胞凋亡、氧化应激反应、自噬、胰岛素代谢等多靶点、多途径发挥治疗AD的作用，其具体机制及物质基础还需通过更深入的实验研究加以验证。