贮存年份对北艾和蕲艾精油成分与抑菌活性的影响研究

蒋志惠，郑婧龙，谷令彪，李志祥，刘运革，马立静，王 敏，申艳红*

1安阳工学院 河南省兽用生物制品研发与应用国际联合实验室；2河南省亚临界生物技术有限公司，安阳 455000

艾草(ArtemisiaargyiH.Lév.& Vaniot)是菊科蒿属植物，多年生草本或略成半灌木状或者小灌木状植物。植株有浓烈香气，茎褐色或灰黄褐色，有少数短的分枝，叶厚纸质，上面被灰白色短柔毛[1]。其全草入药，具有温经、去湿、散寒、止血、消炎、平喘、止咳、安胎、抗过敏等作用[2,3]。古籍将艾草分为北艾、蕲艾、海艾[4]。其中北艾(Beiai)主要分布于北半球温带、寒温带和亚热带地区，为模式标本。蕲艾(Qiai)产于湖北蕲春县，是我国开发最早，应用最广的艾草品种。

《孟子》云“犹七年之病，求三年之艾”。随存放时间的延长，艾叶精油的化学成分会发生改变，精油中的醛类会发生醇化、酯化，叶绿素转化为叶黄素使其颜色发生改变[6,7]。Jin等[5]对1、2、3年份蕲艾艾绒中精油成分进行了研究，结果发现艾绒中挥发性成分的相对含量随着贮存时间的增加而降低，且陈年艾中以大分子挥发性成分为主。灸疗时燃点附近的精油挥发至燃烧部位，产生短时高温，而后精油含量减少，温度下降。陈艾精油含量较低，灸疗时火力温和，可在一定程度上阐明艾灸时用3年陈艾效果最佳的原因。但到目前为止贮存年份对于艾叶精油化学成分的影响尚不明确。此外，研究表明艾草具有抑菌作用[8-10]，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等细菌均具有显著的抑制作用[11,12]，但艾草贮存年份导致化学成分的改变是否影响其抑菌作用亦不明确。故本研究选取3个贮存年份的北艾和蕲艾，通过比较精油提取率和GC-MS/MS分析结果，明确不同贮存年份和不同品种艾叶精油含量与成分的差异；并通过抗菌谱筛选和最小杀菌浓度测定，分析不同贮存年份和不同品种艾叶精油抑菌能力的差异，以期为艾草资源的科学贮存与合理化利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2017年5月份采集的新鲜北艾(河南省安阳市汤阴县扁鹊庙内，坐标114.435 159°35.87 178′N)和蕲艾(湖北省黄冈市蕲春县，坐标115.365 152°30.048 862′N)，在同一贮存条件下分别存储0年、1年和2年。贮存条件依据艾草贮存行业标准：置于清洁、阴凉、干燥、通风的库房内，样品堆放处距离热源2 m以上，室温(10～30 ℃)，周围空气无酸性或其他有害气体，无易燃易爆物品。

供试菌种：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、藤黄微球菌(Micrococcusluteus)、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黄色葡萄球菌耐药菌(Staphylococcusaureusresistant bacteria)、大肠杆菌耐药菌(Escherichiacoliresistant bacteria)、沙门菌耐药菌(Salmonellaresistant bacteria)、李斯特菌(Listeriamonocytogenes)均由国家重点微生物资源实验室提供，大肠杆菌(Escherichiacoli)、沙门菌(Salmonella)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)由西北农林科技大学微生物实验室提供。

仪器：精油提取分离器(常州荣华汉器制道有限公司HDM-2 000D)；恒温培养箱(海智城分析仪器制造有限公司ZXGP-A2 160)；高压灭菌锅(华粤企业集团有限公司华粤行仪器有限公司HVA-110)；气相色谱与质谱联用仪(安捷伦科技有限公司5 977A-MSD)。

1.2 试验方法

1.2.1 水蒸汽蒸馏法提取艾叶精油

艾草前处理：将自然晾干后的艾叶粉碎，过80目筛，放入自封袋中备用。

称取60 g艾叶粉放入三口烧瓶，加入600 mL蒸馏水和4颗沸石，放入精油分离器中，95 ℃加热2 h收集下层的艾露和上层精油。

1.2.2 艾叶精油提取得率的计算

艾叶精油提取得率=M1/M2×100%

M1：艾叶精油重量；M2：艾叶粉质量。

1.2.3 GC-MS测定条件

5 977A-MSD气相色谱条件为：HP-5 ms(非极性毛细管柱，30 m×250 μm×0.25 μm，载气为氦气，流量：10 mL/min)初始温度70 ℃，采用程序升温以10 ℃/min速率升温至95 ℃。再以5 ℃/min速率升温到125 ℃，以6 ℃/min速率升温到180 ℃，以20 ℃/min速率升温到280 ℃，进样量2 μL，分流比15∶1。

质谱分析条件为：离子源为EI，电离电压70 eV，进样口温度200 ℃，离子源温度230 ℃，扫描范围30～600 amu[13]。

1.2.4 药敏片法测定抗菌谱

根据菌种配制相应的培养基，高压灭菌后以每个平板10 mL的体积制成固体培养基，每个平板划分为四个区域，每区分别加入15 μL不同的菌悬液，等待10 min，用无菌镊子将直径为0.6 mm，且浸泡5 μL艾叶精油24 h的药敏片分别放入四个区域中央。放入37 ℃恒温培养箱中培养12 h后，测量抑菌圈直径。以头孢唑啉为阳性对照。

1.2.5 最小杀菌浓度(MBC)测定

制作浓度为20%的艾叶精油稀释液，将浓度为10 000 CFU/mL对数生长期的菌悬液同艾叶精油稀释液混合培养12 h。取以上培养菌液，接种到LB固体培养基上，在37 ℃培养箱中培养12 h，观察平板。若无菌落生长则将艾叶精油浓度降低10%，若有菌落生长则将艾叶精油浓度增加10%，重复以上步骤。不生长菌落的最小浓度即为菌种的最小杀菌浓度(MBC)。

2 结果与讨论

2.1 贮存时间影响艾叶精油提取率

结果如表1所示，随着贮存时间的增加，艾叶精油的提取率下降。存储0年、1年和2年份的北艾和蕲艾精油提取率无显著性差异(P>0.05)，但蕲艾的精油平均提取率高于北艾。

表1 不同贮存时间和品种艾叶精油提取得率Table 1 Effect of different storage time and species of Artemisia on yield of essential oil

2.2 不同贮存时间和艾草品种影响艾叶精油的化学成分

不同品种、不同年份的艾叶精油具有不同的颜色(图1A)。北艾精油2年份、1年份和0年份的颜色分别为浅黄色(a)、黄绿色(b)、绿色(c)。蕲艾精油0年份、1年份和2年份的颜色分别为浅绿色(d)、蓝绿色(e)、蓝色(f)，提示不同贮存年份和品种的艾叶精油化学成分可能存在差异。

采用GC-MS法检测了3个贮存年份的北艾和蕲艾精油化学成分。通过出峰时间和峰面积发现3个贮存年份的北艾和蕲艾精油化学成分和相对含量存在显著差异，图1D、F 中提示0年份和1年份北艾精油中小分子挥发性物质较多，随着贮存年份的增加，大分子挥发性物质随之增加。

成分鉴定表明不同贮存年份和品种的艾叶精油化学成分存在差异性。0年份、1年份、2年份的北艾和蕲艾分别有9种、14种、17种相同成分(图2)。与北艾相比，侧柏酮为蕲艾的特有成分(thujone，图1C 6.124 min，图1E 6.866 min和图1G 6.862 min)。三个存储年份北艾精油之间有16种相同成分，其中主要成分桉油精(eucalyptol)和龙脑(borneol)含量随贮存年份的增加而减少。2年份艾叶精油独有植醇正十四碳烷(tetradecane)，且含量较高(19.99%)。3个存储年份蕲艾精油之间有20种相同成分(图2F)，其中侧柏酮和醋酸冰片酯(bornyl acetate，图1C 11.448 min，图1E 11.428 min，图1G 11.426 min)的含量随着贮存年份的增加而降低。

图1 不同贮存年份北艾和蕲艾精油颜色及其气相色谱图谱

不同贮存年份和品种艾叶精油中萜类成分占比最多，其次是生物碱。随着贮存年份的增加，随之降低(图2G)。通过分析前5种主要的化学成分发现(表2)，不同贮存年份和品种的艾叶精油存在相同成分，3个贮存年份的北艾和蕲艾均含有eucalyptol(桉油精)；0年份和1年份北艾含有2,4,6-trifluoroaniline(三氯苯胺)和3,3,5,5-tetramethyl-6-(2,4,6-trimethyl-benzoyl)-dihydro-pyran-2,4-dione；0年份北艾和1年份蕲艾含有benzoic acid 2,4,6-trimethyl-2,4,6-trimethylphenyl ester；1年份北艾和蕲艾含有benzoic acid,4-propyl-,4-cyano-3-fluorophenyl ester和ethanone,1-[4-(1-methylethyl)phenyl]-；2年份北艾和蕲艾含有caryophyllene oxide(石竹烯氧化物)。

续表2(Continued Tab.2)

2.3 不同贮存年份和品种精油的抗菌谱比较

如图3所示，艾叶精油的抗菌谱较广。从贮存年份上分析，0年份的艾叶精油抗菌谱广、抑菌圈直径长。从品种上分析，北艾精油的抗菌谱较蕲艾精油更广。其中0年份的北艾精油抗菌谱广泛，对沙门菌、枯草芽孢杆菌、沙门菌耐药菌、藤黄微球菌、绿脓杆菌具有显著的抑制作用，但对李斯特菌、金黄色葡萄球菌耐药菌和金黄色葡萄球菌无显著抑制作用。0年份蕲艾精油可有效抑制沙门菌、枯草芽孢杆菌、沙门菌耐药菌、绿脓杆菌和大肠杆菌。1年份蕲艾和北艾精油抑菌圈大小与阳性对照无显著性差异。而2年份北艾和蕲艾精油抗菌谱较窄，对沙门菌、枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌无抑菌效果。

图3 艾叶精油抑菌圈大小Fig.3 Diameter of bacteriostatic zone of different Artemisia species in different storage years (mm)

2.4 不同贮存年份和品种精油的最小杀菌浓度比较

如表3所示，不同品种和贮存年份的艾叶精油的杀菌能力存在差异。整体分析发现，存储时间越短，杀菌能力越强，但金黄色葡萄球菌除外。从品种分析，与0年份蕲艾精油相比，0年份北艾精油对枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌耐药菌、大肠杆菌、大肠杆菌耐药菌、沙门菌耐药菌和绿脓杆菌的最小杀菌浓度较低，说明杀菌能力较高。

表3 艾叶精油对供试菌种的最小杀菌浓度Table 3 MBC of different species Artemisia in different storage years

3 讨论

艾草较其他植物性药材相比，具有贮存年份的特殊性。艾草跟据贮存时间分为0年艾、1年艾、2年艾等。研究表明，艾草不同贮存时间影响其药性，然而具体原因仍不清楚。因此我们选取《本草纲目》中记载的主要品种北艾和蕲艾作为品种的研究对象，以0年、1年和2年贮存时间为研究时限，比较不同年份和品种艾叶精油中的物理性质、化学成分和种类、抑菌能力，进而解析贮存时间对艾叶精油化学成分和抑菌能力的影响。

首先，贮存时间影响艾叶精油的化学成分。比较艾叶精油的提取率发现，艾叶精油的含量随着贮存时间的增加而降低。预实验期同样提取了贮存3年的艾叶精油，提取率为0.06%，由于精油含量较低，我们选取0年、1年和2年贮存时间为研究时限。从不同贮存年份的同种艾叶精油比较发现，3个贮存年份的北艾精油共同具有的次生代谢产物有16种，蕲艾有20种，分别占总产物的12.8%、31.2%，表明次生代谢产物的变化受存储年份的影响。其中，生物碱类的占比整体变化较小，萜类占比随着贮存年份的增加而降低，酯类变化占比无规律，该结果与叶羊等研究结果相似[14]。艾叶精油为挥发性成分，可因与空气和光线接触发生氧化变质、水解反应和重排现象，使其成分相对比重增加，颜色加深[6,7]。我们的研究结果也发现艾叶精油的颜色随着贮存年份的增加而不同，北艾精油分别为绿色、黄绿色、浅黄色，蕲艾精油分别为浅绿色、蓝绿色、蓝色，且随着存储年份的增加，小分子的挥发性物质相对含量降低，大分子的挥发物质相对含量增加。

3个年份的北艾和蕲艾精油均含有1，8-桉油精、樟脑和龙脑，且含量较高。我们前期研究结果发现1，8-桉油精具有抑菌、消炎、抗氧化的作用[15]。龙脑也叫天然冰片，是一种珍贵的医药原料、高级香料和化学原料，在中国和印度被用于食品和民间医药中，具有抗炎和神经保护的作用[16]。樟脑具有驱虫[17]、杀虫、消炎的作用，被广泛地用作化妆品的香味剂、食品的调味剂、家庭清洁剂的常见成分，以及局部应用的止痛剂和治疗轻微肌肉疼痛的发红剂。因此不同品种、贮存时间的艾叶精油具有抗菌、消炎、驱虫等功效，但其药理学活性也存在着双面性，大剂量的樟脑具有神经毒性[17]。分析结果发现，三个贮存年份的蕲艾均含有侧柏酮，而北艾未检测出该成分。研究表明侧柏酮除了具有抑菌作用，还具有较强的神经毒性，因此蕲艾精油作为药物、食品等添加剂的安全性还需要进行评价。

其次，贮存时间影响艾叶精油的抑菌活性。基于化学成分的不同，我们推测贮存年份的不同，其抑菌活性不同。从结果中比较发现，3个存储年份的北艾和蕲艾精油均具有较好的抗菌谱和抑菌活性，与其他年份相比，0年份北艾和蕲艾精油的抗菌谱最广，最小杀菌浓度较低。抑菌活性的改变可能与萜类含量有关。研究表明萜类具有抑菌、杀菌的活性，它可以破坏细胞膜的渗透性[18]，导致核酸等大分子物质的外泄，同时对细胞菌体蛋白的合成和积累有干扰作用。并且萜烯相互作用可诱导细胞呼吸的改变，随后导致微生物氧化磷酸化的解耦联[19]，对耐药菌具有协同抑制的作用，因此，67%的增效剂都属于单萜类和倍半萜类[20]。本实验结果表明艾叶精油中的萜类化合物种类较多，且随着贮存年份的增加而降低。我们通过比较发现，0年份的eucalyptol(桉油精)、β-mycrene(β-月桂烯)、bicylo[3.1.1]heptane,6,6-dimethyl-3-methylene含量较多。研究表明桉油精、月桂烯具有较强的抑菌能力，推测艾叶精油抑菌活性的主要成分为桉油精和月桂烯。与0年份的蕲艾精油相比，北艾精油对枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌耐药菌、大肠杆菌、大肠杆菌耐药菌、沙门菌耐药菌和绿脓杆菌的最小杀菌浓度较低，对金黄色葡萄球菌、沙门菌的最小杀菌浓度较高。说明不同品种艾叶精油对不同细菌的杀菌能力不同，可以有针对性的选择品种使用。

本研究发现不同贮存年份和品种的艾叶精油其化学成分和抑菌活性也存在差异。贮存年份主要影响萜类和酯类的含量比例。与北艾的化学成分相比，蕲艾含有特有成分侧柏酮。另外，0年份的艾叶精油具有较广的抗菌谱，较低的最小杀菌浓度，推测主要的杀菌活性成分为桉油精和龙脑。综上结果，不同存储年份的北艾和蕲艾化学成分与抑菌活性具有较大的差异性，因此艾叶应用在医疗、食品等方面应重新评价不同年份和品种的化学成分及功能。

综上，艾叶精油含量随着贮存年份的增加而降低，且艾叶精油中的化学成分发生变化。其中生物碱类的占比整体变化较小，萜类占比随着贮存年份的增加而降低，酯类变化占比无规律。艾叶精油的抗菌谱较广，从贮存年份上分析，0年份的艾叶精油抗菌谱广。从品种上分析，北艾精油抑菌效果较蕲艾显著。从化学成分上分析，蕲艾精油因含有侧柏酮存在潜在的神经毒性。