草莓果实抗坏血酸含量及相关代谢酶活性对外源硒代蛋氨酸的响应

张妍妍,晋莹莹,高尚,单长卷

（河南科技学院生命科技学院,河南新乡453003）

抗坏血酸（Ascorbic acid,ASA）亦称维生素C（Vitamin C,Vc）,是广泛存在于生物体内的一种抗氧化剂,对动植物的生长发育起到重要作用,由于人类抗坏血酸合成途径相关酶基因的缺失,因此仅能依靠从食物中摄入获取[1].但ASA在一般农作物中含量较低,如何提升果蔬中ASA含量已成为现今研究的焦点问题[2].硒（Se）是人体必需的微量元素之一,缺硒会导致多种疾病,适当补硒则可对人体抗癌、抗毒以及拮抗重金属等机能产生重要作用[3].研究表明,硒在自然界中普遍以有机硒和无机硒两种形式存在,相对于无机硒,有机硒具有安全、高效等优势[4-5],故成为生物补硒的最适选择.本研究中所使用的硒代蛋氨酸（SeMet）便属有机硒范畴.现已证实,通过施硒处理的植物果实中的ASA含量能够得到显著提升[6-8].因此,研究果蔬中ASA合成、再生以及代谢相关酶活性对外源有机硒的响应,对揭示有机硒调控植物果实ASA含量的生理机制具有重要意义.刘丽等[9]、印宁等[10]、朱艺等[11]的研究表明,硒能够显著提升苹果、葡萄及蓝莓果实中ASA、可溶性糖、可溶性固形物等营养物质含量,同时提升果实糖酸比,提高果实品质.孙协平等[6],李登超等[12],王建伟等[13]的研究表明,硒能够通过提高香橙、菠菜、番茄等植物体内谷胱甘肽还原酶（GR）、单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）以及脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）等ASA代谢循环途径中关键酶的活性,进而提升植物体内ASA含量及其抗氧化能力.

近年来,研究者们在对外源硒与草莓果实抗坏血酸方面的研究中取得了一些成果,但多集中于硒质量浓度与ASA含量的关系研究[14-15,7],且前人多以无机硒为研究手段,对运用有机硒调控草莓果实中抗坏血酸含量及相关代谢酶的研究仍鲜有报道.研究通过外源喷施不同质量浓度SeMet处理,对草莓果实抗坏血酸含量、植株总生物量、平均单果质量及ASA相关合成、再生及代谢途径关键酶活性进行研究对比分析,同时筛选出适宜喷施浓度,旨在揭示有机硒调控成熟草莓果实中抗坏血酸含量的生理机制,为有机硒应用于草莓生产中以提升果实ASA含量提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2018年9至11月间进行,地点位于河南科技学院生理生化实验室.供试材料为“甜查理”草莓苗,该品种是北京市农林科学院于2003年自美国引入,因其营养价值高,口感好、抗虫害、耐储运等突出优势,深受消费者及果农青睐,是我国主要栽培的草莓品种之一[16],在我国东北、华北等地区均有广泛栽培.

将幼苗定植于塑料盆中,盆高14 cm,直径15 cm.每盆装培养土2 kg,由泥炭和园土按照7∶3的比例混合而成,同时测得土壤密度1.21 g/cm3,pH值为6.9,有机质含量21.2 g/kg速效氮、速效磷和速效钾含量分别为150.31、167.62和240.23 mg/kg.

1.2 试验设计

选取植株生长状况良好且大小相近的草莓幼苗置于光照培养箱中进行培养,箱体规格为680*620*1 800 cm,有效容积300 L,设置昼夜温度分别为25℃和15℃,昼夜光强为600/0 μmol/（m2·s）,光周期10 h,相对湿度60%.其间利用质量法控制含水量在70%～75%之间.自现蕾期始,对草莓苗进行不同质量浓度SeMet溶液叶面喷施处理,每盆每次喷施溶液20 mL,每隔9 d进行1次,直至果实成熟.参照国家食品卫生标准规定及王晓芳等[17]、鞠明岫等[14]的研究,并结合前期预试验的结果,本研究共设置五个质量浓度处理,分别为 T1（10 mg/L SeMet）、T2（30 mg/L SeMet）、T3（60 mg/L SeMet）、T4（90 mg/L SeMet）四个质量浓度梯度处理及对照组（CK）,对照组仅采用等量清水喷施叶片处理,直至果实成熟,每个处理5个重复,共25盆.

1.3 测定方法

待果实成熟,选取着色80%以上无畸形、病虫害及机械损伤的果实进行同位置破坏性取样,取样后立即进行检测.

1.3.1 抗氧化物质测定 抗坏血酸（ASA）及脱氢抗坏血酸（DHA）含量依照Hodges等[18]的方法进行测定,DHA含量通过所测得ASA与总抗坏血酸之差计算.

1.3.2 抗坏血酸代谢相关酶活性测定 酶液的制备参考单长卷等[19]的方法,每个样品取0.5 g,在液氮中研磨成细粉,置于6 mL浓度为50 mmol/L KH2PO4缓冲液中进行匀浆.缓冲液PH为7.5,内含浓度为0.1 mmol/L EDTA,体积分数为0.3%Triton X-100及体积分数为1%PVP（在提取APX时,缓冲液中另加浓度为1 mmol/L ASA）.将上述体系在2℃下离心15 min（12 000 r/min）,取上清液备用.

抗坏血酸过氧化物酶（APX,EC1.11.1.11）活性采用Nakano等[20]的方法进行测定：单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR,EC1.6.5.4）活性依照Chikahiro等[21]的方法进行测定；脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR,EC1.8.5.1）活性依照Dalton等[22]的方法测定；谷胱甘肽还原酶（GR,EC1.6.4.2）活性依照Grace等[23]方法测定；L-半乳糖1,4内脂脱氢酶（GalLDH,EC1.3.2.3）及抗坏血酸氧化酶（AAO,EC1.10.3.3）以酶活性检测试剂盒（购自南京建成生物工程研究所）进行检测,分别于265 nm和550 nm测定吸光值.

上述各酶活性均以1 min内转化1 μmol底物的酶量记为一个酶活性单位.

1.3.3 单果质量、植株总生物量及硒含量测定 果实平均单果质量通过电子天平测定；植株总生物量通过烘干法进行测定；硒含量采用原子荧光光度计进行测定.

1.3.4 所得数据计算及制图 上述每个指标测定三次并取平均值.所得数据以Office Excel 2019进行计算及制图处理,并以SPSS statistics 25进行差异显著性分析及相关性分析.

2 结果与分析

2.1 不同质量浓度SeMet处理对草莓果实ASA、DHA、ASA+DHA含量及ASA/DHA的影响

不同质量浓度SeMet处理对草莓果ASA、DHA、ASA+DHA含量及ASA/DHA的影响结果如图1所示.

图1 不同质量浓度SeMet处理对草莓果实ASA、DHA、ASA+DHA含量及ASA/DHA的影响Fig.1 Effects of SeMet treatment at different concentrations on the contents of ASA,DHA,total ASA+DHA and ASA/DHA in strawberry fruits

由图1可以看出,经过SeMet处理,草莓果实中ASA、ASA+DHA含量及ASA/DHA的值均有所提升,且三者呈现相似的变化趋势,即随硒质量浓度的增加不断上升,在T3达到顶点随后开始下降.其中,各质量浓度SeMet处理草莓果实中ASA含量与ASA/DHA的值较对照组均有显著提升,ASA+DHA含量则仅T3处理达到显著水平,其余各组仅略高于对照组.此外各质量浓度处理果实DHA含量变化形式与ASA相反,出现先降后升的趋势,在T3处达最低,随后开始回升.各处理均显著低于对照组.说明外源SeMet能够显著提升果实中ASA含量及ASA/DHA的值,在一定程度上提升了ASA+DHA含量,且各质量浓度处理以T3即质量浓度为60 mg/L SeMet处理最为显著.同时显著降低了果实中DHA含量,因此以质量浓度为60 mg/L SeMet处理最为显著.

2.2 不同质量浓度SeMet处理对草莓果实ASA合成代谢关键酶的的影响

各质量浓度SeMet处理下草莓ASA合成、再生及代谢相关酶的活性变化如表1所示.

表1 草莓果实中ASA合成代谢关键酶对不同质量浓度外源SeMet的响应Tab.1 Response of ASA anabolism key enzymes in strawberry fruits to exogenous SeMet atdifferent concentrations（μmol/（min·g））

表1显示了各质量浓度处理下草莓果实GalLDH、MDHAR和GR活性均呈现先高后低的单峰变化,于T3达最大值,随后开始回落,各质量浓度处理均显著高于对照,以T3最为显著,分别高于对照253.3%、103.2%和183.7%；果实中DHAR活性亦呈现单峰变化形式,但峰点前移至T2,且各质量浓度处理下该酶活性均显著高与对照.SeMet处理还显著降低草莓果实中APX活性,从T1至T3,其值逐渐下降,于T3处达谷点,随后开始回升；果实AAO活性变化较为复杂,其值于T1与T3处显著降低,且两者差异并不显著,对照组与T3、T4处理下该酶活性均较高,且三者间差异不显著.各组处理总体变化呈“W”型,说明外源SeMet处理会显著增加草莓果实中GalLDH、MDHAR及GR活性,且三者均以T3处理即质量浓度为60 mg/LSeMet处理最为显著,同时还会显著增加果实中DHAR活性,以T2处理即质量浓度为 30 mg/LSeMet处理最为显著.此外,外源SeMet会显著降低草莓果实中APX活性,亦以T3处理即质量浓度为60 mg/L SeMet最为显著,AAO对SeMet的响应较复杂,T1、T3（质量浓度分别为10和60 mg/L SeMet）处理下该酶活性会显著降低,其余处理则未出现显著变化.

2.3 不同质量浓度SeMet处理对草莓果实平均单果质量及植株总生物量的影响

不同质量浓度SeMet处理对草莓果实平均单果质量及植株总生物量的影响如图2所示.

图2 不同质量浓度SeMet处理对草莓果实平均单果质量及植株总生物量的影响Fig.2 Effects of SeMet treatment at different concentrations on average fruit weight and total biomass of strawberry fruits

如图2可以看出,各质量浓度SeMet处理下草莓果实平均单果质量及植株总生物量变化趋势相对一致,且二者变化趋势与上文ASA含量变化趋势相似,呈现单峰变化形式,且于T3处达峰值,且各组处理均显著高于对照组.说明外源SeMet能够显著提升草莓果实平均单果质量及植株总生物量的值,且二者均以T3即质量浓度为60 mg/L SeMet处理最为显著.

2.4 不同质量浓度SeMet处理下草莓果实中硒的含量

不同质量浓度SeMet处理下成熟草莓果实中硒含量的变化如图3所示.

由图3可以看出,各质量浓度处理下草莓果实中硒的含量随外源喷施质量浓度依次递增,T4处理最高.相比对照组,各组均达显著水平.且各组处理果实中含硒量均达到GB13105-1991《食品硒限量卫生标准》中关于果蔬中硒含量应低于0.1 μg/g的要求[24].

图3 不同质量浓度硒代蛋氨酸处理下草莓果实中硒的含量Fig.3 Selenium content in strawberry fruits treated with different concentrations of selenium methionine

2.5 不同质量浓度SeMet处理下草莓果实ASA、DHA含量及其相关酶与平均单果质量、植株总生物量间相关性分析

成熟期草莓果实中ASA、DHA、ASA+DHA含量、ASA/DHA的值及其相关酶与植株总生物量和果实平均单果质量之间的相关性分析结果如表2所示.

表2 不同质量浓度SeMet处理下草莓果实ASA、DHA含量及其相关酶与平均单果质量、植株总生物量间相关性分析Tab.2 Correlation analysis of ASA and DHA contents and related enzymes with average fruit weight and total plant biomass in strawberry fruits treated with selenomonine at different concentrations.

由表2中可以看出,草莓中ASA含量与DHA呈显著负相关（r=-0.929）,与ASA+DHA、ASA/DHA呈显著正相关（r=0.977,0.997）,同时其含量与APX呈显著负相关（r=-0.928）,与MDHAR呈显著正相关（r=0.952）,并与果实单果质量和植株总生物量间呈显著正相关关系（r=0.995,0.989）.说明草莓中ASA的积累与APX、MDHAR两种酶关系较为密切,同时ASA含量也与草莓的有机物积累与产量存在较为密切的联系.除此之外,GalLDH与总抗坏血酸含量间关系较为密切,且其活性与MDHAR活性相关性较强,说明二者之间可能存在较为密切的反馈调节关系.另外分析发现虽然作为ASA代谢及再生途径的关键酶,但在本研究中AAO与DHAR与其他物质含量或酶间的相关性不显著.说明这二者可能在ASA代谢循环整体过程中产生的作用较小.根据上述结论,经过线性回归分析,得出ASA含量（Y）与果实平均单果质量（X1）、植株总生物量（X2）之间关系的表达式为：Y=55.441-1.749 X1+6.799 X2（R2=0.998）以期为今后相关研究提供对比参考.

3 讨论

研究表明外源SeMet处理能够显著提升草莓果实中ASA及总抗坏血酸含量,这与杜少平等[25]、马龙等[26]、王清华等[27]在对西瓜、番茄及冬枣等植物的研究结论基本一致.研究中硒显著提升了抗坏血酸合成关键酶GalLDH的活性.虽然有研究表明草莓中的ASA合成途径不唯一（包括GDP-甘露糖途径和D-半乳糖醛酸途径）,但该两种ASA合成途径最终均需要通过GalLDH的催化方能生成L-抗坏血酸[28].因此GalLDH活性的增强可以直接导致总抗坏血酸含量增加.而该酶活性增强的原因可能是硒对光合作用的影响致使源端光合产物增多导致的,ASA作为光合作用的次生代谢产物,其含量与光合作用效率密切相关.胡万行等[29]在对马铃薯的研究中发现,硒能够提升其叶片中光合色素含量进而提升光合作用效率.孙协平等[30]的研究同样表明,硒能够显著提升葡萄叶片的光合效率且与植株抗氧化能力具有较强相关性.金小琬等[31]、吴季蓉等[32]的研究均表明,硒能够促进光合色素比例优化,降低植物叶片的光能损耗,进而提升植物的光合效率.这点也能够从文中硒处理下草莓果实的生物量及单果质量的影响得到支撑.光合作用的提升促使更多光合产物积累,最终提高了草莓果实干物质积累和果实产量.

此外,本研究发现外源SeMet处理能够显著提升ASA/DHA的值,这与孙协平等[6]的研究结果相对一致.ASA/DHA能够直接反应植物的生长状态,其值愈高,说明植物所处生长环境愈佳,反之则说明植物可能受到外界胁迫等不利因素的影响.大量研究表明,硒能够帮助植物抵御胁迫,维持细胞膨压,缓解氧化压力[33].如图3[34]所示,从酶活性的角度讲,本研究中外源SeMet处理能够显著降低APX活性,这与李登超[35]等研究结果保持一致.在植物体内,APX是植物ASA代谢过程中的关键酶之一,该酶能够以ASA作为电子供体还原H2O2生成H2O,进而生成MDHA（单脱氢抗坏血酸）,MDHA并不稳定,在植物体内会经过非酶作用生成DHA.施硒可以激活植物体内的GSH-PX（谷胱甘肽过氧化物酶）,该酶能够催化GSH（谷胱甘肽）生成GSSH（氧化型谷胱甘肽）,同时清除较多H2O2及其他有害活性氧,导致APX反应底物减少,致使其活性下降.同时,研究还发现SeMet处理下草莓果实中GR活性得到显著提高,这与前人研究结果保持一致[36].硒元素作为GSH-PX活性中心硒半胱氨酸的重要组成元素,其含量的增加可直接导致GSH-PX活性增强[37],而GSH-PX属谷胱甘肽依赖性酶,在其清除H2O2过程中必须依靠GSH作为底物,这也进而促进GR活性的提高,产生更多GSH,同时充足的GSH含量有利于DHAR将DHA还原为ASA的过程,这也同时解释了DHAR活性提高的原因,APX活性降低和DHAR活性增强均能促使整个ASA-GSH循环倾向于ASA还原方向,进而提升果实内ASA含量.

但上述机制并不能解释研究中SeMet处理对MDHAR活性的提升,由于近年来对该酶的研究较少,仍未发现该酶对外源硒响应的相关机制,通过本研究中分析发现,该酶的活性与GalLDH活性以及植株总生物量、平均单果质量呈现显著正相关关系,因此可以推测MDHAR可能与GalLDH之间存在密切联系,或与光合产物积累及光合作用之间存在较为密切的相互关系,以期为今后研究提供参考.

图3 不同质量浓度Semet处理下草莓果实中硒的含量Fig.3 Selenium content in strawberry fruits treated with different concentrations of SeMet

本研究还发现,虽然外源喷施SeMet会显著提高草莓果实中ASA含量,但各质量浓度梯度对草莓果实中ASA代谢相关酶的影响机制各不相同,其中在质量浓度为10 mg/L的SeMet处理下,草莓果实主要通过提升MDHAR活性进而促进MDHA还原为ASA,从而达到提升抗坏血酸含量的效果.但由于硒的抗氧化作用,致使DHA含量处于较低水平,因此该途径下积累的ASA在各组处理中较低；而质量浓度为30 mg/L硒代蛋氨酸处理下草莓果实降低APX活性,减少ASA代谢消耗,同时增强DHAR活性,促进DHA还原为ASA来增加果实中抗坏血酸含量,但由于该质量浓度处理下,GR的活性较低,致使GSH还原量下降,在一定程度上限制了脱氢抗坏血酸的还原过程,且GalLDH活性不高,导致抗坏血酸合成量有限,故该质量浓度处理下草莓果实中抗坏血酸含量并未达最高；在质量浓度为60 mg/L的SeMet处理下,草莓果实中GalLDH、MDHAR、GR均处最优水平,从合成及还原两个途径提高果实中抗坏血酸含量,同时显著降低了果实中AAO活性,有效减少了代谢消耗,故使该质量浓度处理下草莓果实抗坏血酸含量在各组处理中达最优水平；而在质量浓度为90 mg/L的SeMet处理下,虽然各途径合成酶均高于对照组,但活性较质量浓度为60 mg/L均有所下降,这可能是因为过量的硒致使草莓果实出现中毒症状,影响其生理过程正常进行,故其ASA含量较质量浓度为60 mg/L处理有所下降.造成上述现象的原因可能是因为硒对不同种类酶的作用机理不同,亦或是不同种类酶对硒质量浓度的耐受性存在差异导致的.为验证上述规律,今后还将对硒处理下各时期草莓果实内的相关指标进行跟踪测定,以期更全面地阐述硒促进草莓果实ASA积累的形成原因.

4 结论

不同质量浓度SeMet处理对提升草莓ASA含量的机制侧重各不相同,质量浓度为10 mg/L处理主要通过提升MDHAR活性；质量浓度为30 mg/L处理主要通过降低APX,同时增强DHAR活性；质量浓度为60mg/L处理主要通过提升GalLDH、MDHAR、GR活性进而提升果实中ASA含量；质量浓度为90mg/L处理下各ASA合成及再生酶活性较质量浓度为60 mg/L处理有所降低.草莓果实中ASA含量与APX、MDHAR关系较为密切；GalLDH与MDHAR之间相关性较为显著,同时二者均与果实有机物积累过程存在密切关联.外源SeMet处理能够显著提升草莓果实中抗坏血酸含量、果实平均单果质量及干物质质量积累,以质量浓度为60 mg/L处理效果最佳,在符合国家相关标准对于硒含量要求的前提下,可达到生物强化的效果,适宜应用于生产中以提升果实品质及产量.