大葱叶际生防细菌筛选及对紫斑病防效研究

孙婷婷,赵松宇,王新法,秦明一,张超,田雪亮

（1.河南科技学院河南省生物药肥研发与协同应用工程研究中心,河南新乡453003；2.长江师范学院,重庆408100）

大葱紫斑病是大葱的主要病害之一,多发生在大葱生育后期,可危害大葱叶片、花梗,也可危害鳞茎.发病严重的大葱叶片和花梗枯死,鳞茎腐烂,导致大葱产量严重下降.该病的病原菌为香葱链格孢,属半知菌亚门[1-2].除了危害大葱,该菌还能危害洋葱、蒜、韭菜等重要的蔬菜作物.大葱紫斑病的分生孢子借风雨传播,经气孔或伤口侵入大葱.在适宜的条件下,病菌迅速繁殖,扩大侵染,导致发病迅速加重[3].此外,该病在大葱贮藏期还可继续发生,造成大葱叶片腐烂,降低大葱商品价值.

目前,大葱紫斑病的防治主要采用培育无病种苗、轮作、加强栽培管理和喷施化学药剂.喷施杀菌剂是当前常用方法,但是长期使用会造成农药残留,从而导致大葱品质下降,危害人体健康.此外,杀菌剂大量施用还能造成病原菌抗药性提高,加大防治难度.生物防治具有靶标生物选择性强、环境兼容性好、不易产生抗药性等优点[4],具有广阔的发展前景.目前,我国化学农药污染较为严重,随着化学农药减施增效技术的大力推广,利用微生物防治植物病害的地位愈加重要.

植物叶际存在大量的微生物,被称为叶际微生物.植物叶际微生物包括细菌、真菌、放线菌等,其中以细菌数量最为丰富.大部分叶际微生物对植物有益,能有助于帮助植物固氮、提高植物抗性、帮助植物抵抗病原菌侵染等[5].目前,从植物叶际分离生防细菌用于防治植物叶部病害已经成为挖掘生防资源的主要途径[6].因此,研究从大葱叶际分离并筛选对大葱紫斑病菌有较好生防作用的细菌,为以后深入开展大葱紫斑病生物防治奠定基础.

1 材料与方法

1.1 大葱叶际细菌分离

样品采集于河南省新野县大葱种植基地.从大葱田间随机选取10株大葱,每株大葱用无菌剪刀剪取1张顶叶,称取30 g.然后将大葱叶片剪成长度3 cm叶段,放入无菌三角瓶中.再向三角瓶中加入50 mL无菌磷酸盐缓冲液,超声波（40 Hz）清洗5 min.然后将大葱叶片取出,剩余洗脱液经8 000 r/min离心5 min,弃去上清液,留下沉淀,沉淀中包含大葱叶际微生物.将沉淀转移至2.0 mL无菌离心管,用无菌磷酸盐缓冲液定容至1 mL.为了防止菌落重叠,难以纯化等问题,将悬浮液稀释100万倍[7].取200 μL稀释液均匀涂布于营养琼脂（NA）固体平板上,置于28℃培养箱培养48 h.共设置10个重复.根据菌落的形态及颜色等挑取不同的单菌落至NB培养液,于28℃恒温震荡培养箱中震荡（150 r/min）培养24 h,然后于4℃保存备用.

1.2 拮抗细菌筛选

采用对峙培养法筛选大葱紫斑病生防细菌[8].首先将大葱紫斑病菌饼（直径5 mm）接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板中央,然后采用十字交叉法距离菌饼2 cm接种4株大葱叶际细菌.将平板放入28℃恒温培养箱中培养7 d后观察有无抑菌圈出现.每个处理3次重复,设清水对照.选择抑菌效果好的叶际细菌与大葱紫斑病菌两两对峙培养,培养条件同前.待对照菌落菌丝即将布满整个平板时,测量生防菌对峙的大葱紫斑病菌落的直径,按照公式（1）计算抑菌率.

抑制率/%=（对照病原菌菌落直径-处理病原菌菌落直径）/对照病原菌菌落直径×100. （1）

1.3 拮抗细菌形态和分子鉴定

将生防细菌X85菌株点接到营养琼脂平板,置于28℃培养3 d,观察菌落形态、颜色、边缘特征等.利用扫描电子显微镜观察菌体形态特征,并测量菌体大小.采用菌落PCR扩增生防细菌X85菌株的16SrDNA序列,引物为 27F（5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和 1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）[9].PCR扩增体系为 20 μL：菌液模板 1 μL,正向引物和反向引物各 1 μL,Taq 酶 0.3 μL,Buffer 2 μL,dNTP 1.2 μL,其余用dd水补足.PCR扩增条件：94℃预变性3 min,94℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸90 s,31个循环,最后72℃稳定5 min.PCR产物经质量分数1%琼脂糖凝胶电泳验证后,送到武汉金开瑞生物工程有限公司测序.所得序列在NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）上进行BLAST比对,下载物种相近的序列,然后采用MEGA软件以邻接法构建系统进化树[10].

1.4 拮抗细菌防效田间测定

将X85接种到NB培养基,振荡培养48 h,作为生防菌剂.选择大葱紫斑病重病田,设置3个小区,每个小区10 m2.大葱种植后2个月,接种生防菌剂.选择阴天早晨,每个小区喷雾生防菌剂100 mL.以无菌水为对照.20 d后调查大葱叶片紫斑病发病情况,统计病情指数.

病情分级标准：0级,无病斑；1级,病斑占整个叶面积的5%以下；3级,病斑占整个叶面积的6%～10%；5级,病斑占整个叶面积的11%～20%；7级,病斑占整个叶面积的21%～50%；9级,病斑占整个叶面积的51%以上[11].按照公式（2）根据处理和对照病情指数计算防效.

2 结果与分析

2.1 拮抗细菌筛选

采用培养法从大葱叶际共计分离到385株细菌,叶际培养细菌分类结果如图1所示.

图1 叶际培养细菌分类Fig.1 Taxonomy of phyllosphere bacteria at genus level

由图1可以看出,在属水平上,嗜甲基杆菌属（Methylobacterium）比例为32.5%,其次为鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）,比例为 16.9%,微杆菌属（Microbacterium）比例为 15.8%,假单胞菌属（Pseudomonas）比例为14.0%.这些细菌比例较高,为优势细菌类群,在大葱叶际细菌群落中占据主导地位.其他菌,如泛菌属（Pantoea）、抗锑斯科曼氏球菌属（Skermanella）、不动杆菌属（Acinetobacter）、沙雷氏菌属（Serratia）数量较少,为非优势菌群.

所有分离的细菌与大葱紫斑病菌进行对峙培养,发现32株对大葱紫斑病菌具有一定的拮抗能力.结果如图2所示.

图2 X85对大葱紫斑病菌菌落和菌丝的抑制作用Fig.2 Inhibition of X85 against colony and mycelium of A.porri

由图2-A可以看出,X85菌株表现出较强的拮抗活性,并产生明显的抑菌圈,抑制大葱紫斑病菌丝延伸.从图2-B可以看出,在显微镜下观察到大葱紫斑病菌丝膨大,畸形.这表明大葱紫斑菌丝的细胞壁被X85菌株产生的活性物质所破坏.X85菌株对大葱紫斑病菌的抑制率达到67.5%,抑菌效果最好,因此进行下一步分析.

2.2 拮抗细菌的物种鉴定

X85菌落和菌体形态特征结果如图3所示.

图3 X85菌落和菌体形态特征Fig.3 Morphological characteristics of colony and cell body

由图3-A可以看出,在NA培养基上,X85菌落呈乳白色,半透明,表面光滑,边缘较为规则.由图3-B可以看出,电子显微镜下 X85 菌体呈杆状,两端钝圆,大小为长 1.0～1.1 μm,宽 0.4～0.6 μm.

X85菌株16S rDNA电泳图结果和X85菌株16S rDNA序列进化树结果分别如图4和图5所示.

图4 X85菌株16S rDNA电泳图Fig.4 The electrophoretogram of 16S rDNA

图5 X85菌株16S rDNA序列进化树Fig.5 Phylogenetic tree of 16S rDNA

图4 所示,X85菌株的16S rDNA序列长度约为1 436 bp.在NCBI进行BLAST比对分析,发现X85菌株与Pseudomonas lini的相似度最高.从图5可以看出,菌株X85在MEGA进化树上与P.lini位于同一进化分支,是P.lini的近似种.结合形态特征和16S rDNA序列鉴定,确定X85菌株为亚麻假单胞菌.

2.3 X85菌株田间防效的测定

从图6可以看出,经过X85生防菌剂处理后,大葱紫斑病病情指数为17.4,而对照病情指数为47.1,差异显著（P＜0.001）,综合防效为63.1%.此外,菌剂处理大葱叶片浓绿,单株质量、株高明显优于对照处理,表明该菌还能够促进大葱生长.

对照和处理大葱紫斑病情指数结果如图6所示.

图6 对照和处理大葱紫斑病情指数Fig.6 Disease index of Alternaria leaf spot under treatment and control

3 讨论

研究从大葱叶际分离的亚麻假单胞对大葱紫斑病具有较高的防效.植物叶际生活着大量微生物,包括细菌、真菌、藻类等,其中细菌的数量最多.相对于其他植物叶片平展,大葱的叶面积相对较小,且蜡质层较厚,因此大葱叶际微生物的数量可能相对较少.大葱叶际微生物主要包括嗜甲基杆菌属、鞘氨醇单胞菌属、微杆菌属、假单胞菌属等.其中嗜甲基杆菌数量最多,比例为32.5%,其次是鞘氨醇单胞菌属,比例为16.9%.这与他人研究大豆、苜蓿和拟南芥叶际微生物的结果基本一致[12],表明这两类菌在植物叶际中占主要地位.

嗜甲基杆菌可以利用植物叶片细胞壁去甲基化过程中产生的甲醇[13].叶际微生物蛋白组分析也表明,嗜甲基杆菌的甲醇降解相关酶类非常丰富[14].甲醇对植物具有一定的毒害作用,植物可能利用嗜甲基杆菌来降解甲醇.本研究中嗜甲基杆菌在大葱叶际细菌群落中为优势菌群,可能也起到相似的作用.此外,嗜甲基杆菌能够定植到植物根系,提高植物抗逆性,促进植物生长,提高植物产量[15-16].研究嗜甲基杆菌能否促进大葱生长有待进一步明确.研究表明,氨醇单胞菌能够释放挥发性有机物,通过多种单加氧酶和双加氧酶降解二甲苯和2,4-二氯苯氧乙酸,促进植物生长,提高植物抗旱能力[17-20].本研究中,该菌为优势细菌,可能也起到提高大葱抗逆性,增强大葱长势的作用.

假单胞菌是一类分布广泛的革兰氏阴性细菌,能够产生多种活性代谢产物,诱导植物产生抗病性,从而抵抗病原微生物的侵染[21-23].本研究中亚麻假单胞能够有效抑制大葱紫斑病菌丝的生长,造成菌丝膨大畸形,抑菌效率为67.5%.耿本聪和徐昭稀研究发现尼柯霉素能够有效抑制大葱紫斑病分生孢子萌发,导致菌丝畸形[24].由此推断,亚麻假单胞可能产生破坏大葱紫斑病菌丝细胞壁的活性物质,从而导致菌丝畸形.亚麻假单胞一般生活在植物根际土壤中,生态适应性较强[25].研究从大葱叶际分离到亚麻假单胞,表明该菌也能够在植物叶际生存.

常栋等发现亚麻假单胞菌对烟草黑胫病有很好的防治效果,抑制率高达94%,并且该菌株的发酵液可显著促进田间烟株的株高、茎围以及有效叶片数[26].本研究中亚麻单胞菌对大葱紫斑病的田间防效为63.1%,低于抑快净52.5%水分散粒剂对大葱紫斑病的76.3%防效,与世高水分散粒剂防效62.32%相当,高于克得灵可湿性粉剂（防效60.28%）和氟硅唑质量浓度为400 g/L乳油（防效54.45%）[27].总体来看,亚麻假单胞菌对大葱紫斑病的防治效果较好.

研究从大葱叶际分离到亚麻假单胞菌,且对大葱紫斑病抑制作用.后续应深入开发该菌菌剂,并进行大面积应用推广.