抗重金属镉离子鼠源性多克隆抗体的制备与鉴定

周叶,杨树宇,陈俊杰,刘长忠,王自良,姜金庆

（河南科技学院动物科技学院,河南新乡453003）

随着全球经济、工业化进程的高速发展,超自然负荷的废弃物造成了显著的重金属污染.据我国生态环境部和环境保护部调查显示,截至2017年末,水体的重金属污染物达182.54 t,10%的耕种土地约1 000万公顷已受污染[1-8],其中重金属镉难降解易迁移,在特殊的生物地球化学循环中不断转化,造成了“镉大米”粮食污染事件,诱发人类“痛痛病”、免疫系统障碍等镉引起的急慢性中毒性疾病,严重危害公共卫生安全[9-11].因此,如何有效防治重金属的动态性污染,保障食品、生存环境安全等至关重要.而重金属离子的准确检测是实现防控的前提,这就要求检测技术要不断向灵敏、快速等方向发展.

重金属离子检测通常基于原子电化学特性、光学反应原理,如原子吸收光谱法（AAS）,电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP）、电感耦合等离子体原子发射光谱质谱仪法（ICP-MS）、原子荧光光谱法（AFS）,阳极溶出伏安法（ASV）等电化学传感器技术[12-17].根据样品的特点选择这些方法可实现重金属离子的高灵敏性检测,但因其操作条件苛刻、价格昂贵,常常现场检测应用受限.

而基于特异性抗原抗体反应的免疫学检测技术,如酶联免疫吸附法（ELISA）、胶体金标记免疫层析测定法（GICA）等,以其可修饰、快速、操作简便、灵敏度高的优点被广泛应用于毒素、药物、重金属等环境污染和危险物的检测[18-20].近年来,抗镉、汞、铅等重金属离子的人工抗原和抗体的制备方法不断发展,但获得高效特异性单抗所需时间长、难度大,限制了该技术的应用.本研究将合成重金属离子人工免疫抗原与异源性包被抗原,采用快速免疫法,设置不同免疫方案,筛选出稳定高效特异性强的小鼠多抗血清,进行多抗的效价、敏感性、特异性分析.为镉离子免疫学快速检测方法的建立和检测产品的开发打下基础.

1 材料与方法

1.1 试验材料

二氯化镉（CdCl2）,Alfa Aesar产品；异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸（ITCBE）、乙二胺四乙酸（EDTA）,DOJINDO产品；牛血清白蛋白（BSA）,Pierce产品；鸡卵清蛋白（OVA）,Solarbio产品；弗氏完全佐剂（FCA）、弗氏不完全佐剂（FIA）,均为Sigma产品；HRP-山羊抗小鼠IgG,中杉金桥产品；SPF级Balb/C小鼠,郑州大学医学院实验动物中心供.

DU800紫外分光光度计,美国贝克曼公司；Optima2100DV型电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP）,美国PE公司；MK3多功能全自动酶标仪,美国Thermo公司.

1.2 试验方法

1.2.1 人工抗原的制备与鉴定 参考张海棠等[21]的方法,将ITCBE上多齿配体端与Cd2+离子螯合,活性基团端与载体蛋白成肽,具体操作为：称取5 mg ITCBE溶于DMSO制备金属螯合剂溶液,称取等物质的量CdCl2,溶于HEPES缓冲液形成Cd2+溶液,调节pH值至7.0,两液混合反应制备Cd-ITCBE半抗原；称取一定量BSA溶于HEPES制备载体蛋白溶液,将上述半抗原加入到蛋白中,室温稳定反应24 h,制备Cd-ITCBE-BSA.Cd-EDTA-OVA制备方法同上,Cd-EDTA标准阻断液制备方法同Cd-ITCBE半抗原.

配制BSA、OVA标准液,采用Bradford法,检测上述人工抗原的蛋白浓度,然后以PBS将其稀释至质量浓度为1.0 mg/mL,用紫外分光光度仪检测样品在200～800 nm下的吸收曲线,对比各曲线波动走势,分析人工抗原的偶联特性.将样品作适度稀释,用ICP-MS检测仪上机检测Cd-ITCBE-BSA、Cd-ITCBE-OVA中Cd2+的含量.

1.2.2 小鼠免疫 将Cd-ITCBE-BSA与佐剂按照1∶1充分乳化,采用快速免疫法免疫三组Balb/C小鼠[22],每组 5 只,编号 H1～H5,M1～M5,L1～L5.首次免疫选用 FCA 乳化,免疫蛋白量分别为 60 μg/只、30 μg/只、10 μg/只.背部皮下接种,加强免疫时用FIA乳化,间隔时间均为3周.第4次免疫10 d后断尾采血,采用质量浓度为2 μg/mL的Cd-ITCBE-OVA包板,初步鉴定抗血清效价与敏感性.

1.2.3 小鼠多克隆抗体的制备 将五只免疫小鼠断头取全血,37℃自然凝血析出血清,之后进行1500 r/min离心取上清,小剂量分装后加入质量分数为0.01%叠氮钠防止细菌污染,于-20℃长期存放.

1.2.4 多克隆抗体特性鉴定 效价测定：将纯化后的多抗腹水稀释,采用棋盘滴定法确定包被原最佳包被浓度,间接ELISA测定抗体效价,确定P/N≥2.1的抗体稀释倍数即为效价,确定吸光值OD450接近1.0的抗体稀释倍数为最佳反应浓度.抗体亚类鉴定采用间接ELISA法,具体操作依照产品说明书.

敏感性检测：在最佳优化试验条件下,采用间接竞争ELISA法,首先将不同浓度的Cd-EDTA标准阻断液与抗体在一次性离心管中混合反应,然后移液至Cd-ITCBE-OVA包被的酶标板上,37℃反应10 min后洗板三次.根据酶标二抗的定性定量显色结果,绘制吸光值与标准阻断液浓度常用对数值的曲线,回归分析计算抗体的IC50值.

特异性检测：用 Hg2+、Cu2+、Zn2+、Pb2+、Cr3+、Mo6+、Fe3+、Co2+离子分别与 EDTA 螯合制备半抗原,采用icELISA法测定不同离子的IC50值,计算交叉反应率CR=IC50（Cd-EDTA）/IC50（其他）.

2 结果与分析

2.1 人工抗原的鉴定

Bradford法检测出Cd-ITCBE-BSA与Cd-EDTA-OVA的蛋白质量浓度分别为8mg/mL和6.45 mg/mL.紫外扫描图如图1所示.

图1 Cd2+人工抗原紫外扫描图Fig.1 UV scanning of Cd2+artificial antigen

由图1可知,合成的Cd-ITCBE-BSA最大特征吸收波长较BSA发生蓝移,说明载体蛋白上原有基团发生变化,人工抗原偶联成功.

通过ICP-MS法检测Cd-ITCBE-BSA与Cd-EDTA-OVA中的镉元素含量如表1.

表1 镉含量ICP-MS检测结果Tab.1 Detection results of cadmium content by ICP-MS

2.2 小鼠免疫

间接ELISA测定生长状态良好的四组免疫小鼠血清效价,三组小鼠抗Cd2+血清效价均达到了10-3～10-4,Cd-ITCBE-BSA有效刺激小鼠产生了抗体.每隔3 d测定一次抗血清效价,共测检测3次,结果表明中、低剂量免疫组小鼠抗血清效价数据变动较小.对抗血清进行icELISA试验鉴定其对Cd-EDTA的敏感性,半抗原与高、中剂量组小鼠血清反应均呈现明显的线性阻断,其中M-3号小鼠敏感性最强,经计算其抗血清IC50质量浓度为370.82 μg/L；低剂量组小鼠血清icELISA检测结果线性关系不明显.因此,选择中剂量免疫组小鼠进行下面的研究.

2.3 小鼠多克隆抗体的制备与鉴定

2.3.1 多克隆抗体血清的分离 收集小鼠全血于离心管中,倾斜放置,自然析出淡黄色上清,每只小鼠平均可收集0.5 mL,将抗体血清小剂量分装保存.

2.3.2 多克隆抗体效价测定 间接ELISA检测小鼠多克隆抗体,抗体效价在1.28×10-4～5.12×10-4.结果见表2.M1、M2、M3号小鼠抗体效价相对较高.

表2 Cd-ITCBE-BSA免疫小鼠多抗血清效价Tab.2 Titer of polyclonal antibody in mice immunized with Cd-ITCBE-BSA

2.3.3 多克隆抗体敏感性分析 采用icELISA法,对M1、M2、M3号小鼠抗体进行敏感性检测,建立标准曲线如图2所示.

图2 间接竞争ELISA标准曲线Fig.2 Standard curve of indirect competitive ELISA

抗体的 IC50质量浓度在 368.70～639.06 μg/L,最低检测限 IC20质量浓度在 25.53～38.09 μg/L,其中 M3号小鼠抗体标准曲线拟合方程为y=0.1123x-0.1638（R2=0.9912）,计算IC50质量浓度为368.70 μg/L,检测限质量浓度为25.53 μg/L.根据GB 2762-2017《食品安全国家标准食品中污染物限量》谷物、果蔬、肉蛋、水产动物中的镉限量质量浓度为50～500 μg/L,该多抗能够满足对重金属镉的定量残留检测.

2.3.4 多克隆抗体特异性分析 经检测分析,M3 小鼠抗体与 Cu2+、Zn2+、Pb2+、Cr3+、Mo6+、Fe3+、Co2+离子半抗原螯合物交叉反应率较低,检测结果如表3所示.

表3 多抗血清与其他金属螯合物的交叉反应Tab.3 The cross reaction between polyantibody serum and other metal chelates

由表3可以看出，抗镉离子多抗仅与Hg-EDTA有明显的反应,经计算交叉反应率最高为72.58%.

3 结论与讨论

3.1 双功能螯合剂的选择

重金属离子相比其他小分子抗原,不具有可利用基团,不能直接与载体蛋白偶联刺激动物体产生免疫反应,需要借助双功能螯合剂,因此所产生的多抗不仅能够识别离子螯合剂半抗原、还能识别螯合剂连接桥、以及载体上部分抗原表位,产生桥抗、载体抗体干扰试验.在制备免疫原与包被原的过程中,为提高检测灵敏度,应考虑到桥抗、载体抗体的影响,选用不同螯合剂.张云显[23]等以DTPA与EDTA分别作为免疫原与包被原制备的偶联剂,实现了多抗的制备与鉴定.试验采用经典双功能螯合剂ITCBE合成免疫原,其既能有效结合金属离子又能与载体蛋白偶联发挥免疫效应,具有操作简单、反应体系温和、产物稳定的特点.包被抗原则以EDTA作为偶联桥,在保留抗体识别Cd-EDTA位点的同时避免了抗原上其他抗原决定簇的干扰,以异源性检测的方式提高了检测的灵敏度和可信度.

3.2 重金属离子抗体的制备

实现免疫检测的前提是制备灵敏、特异的抗体.1985年,Reardan等[24]成功制备了金属In3+螯合物的抗体,为重金属离子免疫学检测开拓了方向,目前关于Hg2+、Zn2+、Cu2+、Cd2+等重金属离子螯合物特异性抗体的制备也有报道[25-28],但重金属离子免疫学检测技术的应用并不普遍.抗重金属离子单克隆抗体、单链抗体、纳米抗体等制备周期长、难度大、成本高,无法为实际检测提供稳定试剂支撑.因此,制备高效价的多克隆特异性抗体对此意义重大.唐佳佳等[23]将抗镉细胞株B8,接种于Cd-ITCBE-BSA免疫的Balb/C小鼠,获得了效价达到1∶640 00的腹水多抗,吴峰等[30]将NS1瘤细胞以腹腔注射的方式,刺激汞、镉人工抗原免疫的小鼠,成功制备出腹水多抗,但这些方法亦需要细胞储备.试验在成功制备人工抗原的基础上,筛选出了不同免疫方案下,高效价、敏感高、稳定性好的小鼠多抗血清.该抗体的制备周期短,稳定性高,实用性强,可接种大鼠、兔子等试验动物,获得足量抗体,能为镉离子ELISA检测试剂盒、胶体金试纸条的开发提供抗体支持.

3.3 抗体特异性分析

重金属离子作为带电离子,本身不能刺激机体产生免疫原性,当同价重金属离子与相同螯合剂成键,重金属离子的抗原特征可能暴露不明显,如Jones等[31]研究证明Hg-EDTA和Cd-EDTA三维结构高度相似,抗原特性差异不明显.这就造成了抗体识别原子半径相似所带电荷相同的重金属离子时出现交叉反应,是重金属免疫学检测的一个干扰,需要我们在检测方法上进行优化,如进行镉离子的特异性富集,或干扰离子的沉淀去除,提高检测结果的可靠性.此外,Peiwu Li[32]研究表明免疫原剂量对抗体特异性谱具有影响,免疫剂量大更有利于形成广谱的特异性抗体,尤其是采用通用半抗原.本研究根据目前文献研究,设置了中、高、低剂量免疫方案,旨在挑选出特异性最佳的多抗血清,为后续研究提供可靠抗体支持.