河南省小麦茎基腐病病原的鉴定及其对13种杀菌剂的敏感性测定

周锋,胡海燕,范玉闯,王金叶,郭子灏,李成伟

（1.河南省粮食作物基因组编辑工程技术研究中心河南新乡453003；2.河南科技学院资源与环境学院,河南新乡453003；3.河南科技学院生命科技学院；河南新乡453003）

小麦是我国的三大主要粮食作物之一,年产量为主要粮食作物总产量的20.79%,在我国粮食作物中占据了重要的地位[1].小麦茎基腐病（Wheat crown rot）是一种典型的由多种病原菌复合侵染引起的土传性真菌病害,从小麦分蘖期到成熟期均可发生且在世界各小麦产区均有分布,严重影响了小麦的产量[2-13].近年来,由于种植方式的转变及秸秆还田技术的大面积推广,一些腐生菌在田间不断积累[14].同时,以河南省、山东省和江苏省为代表的我国小麦主产区的小麦茎基腐病频繁发生,且呈现出病害加重的趋势[13-14].已有研究表明小麦茎基腐病至少可由16种以上的镰孢菌侵染引起,但由于受到地域差异的限制,不同地区之间的致病优势种存在明显的差异[9,15].为了进一步明确河南省新乡市红旗区小麦茎基腐病的优势菌源,研究开展了该病害病原物的分离、纯化及rDNA-ITS的分子鉴定研究,试图从分子水平确定其病原,为病原物的诊断提供依据.

此外,由于该病在小麦的分蘖期至成熟期均可发病,且目前尚未选育出能够有效抵抗小麦茎基腐病的抗病小麦品种,所以当前对其仍以化学药剂防控为主,但是选用何种杀菌剂对其进行防控具有较好的效果,目前尚不完全清楚.为此,研究开展了该病原菌对13种杀菌剂的敏感性测定试验,以期为该病害的化学防控提供指导.

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试试剂 PDA培养基：马铃薯200.0 g；葡萄糖20.0 g；琼脂条20.0 g；dd H2O定容至1.0 L.

2×Taqmastermix,北京康为世纪生物科技有限公司；DNAMarker2000,北京博迈德基因技术有限公司.

1.1.2 供试杀菌剂 本研究中所用到的杀菌剂如表1所示.

表1 供试杀菌剂信息Tab.1 Fungicides used in the current study

1.1.3 主要仪器设备 SW-CJ-2F型双人双面净化工作台,浙江苏净净化设备有限公司；2720型PCR扩增仪,美国Applied biosystems应用生物系统公司；HP2500G型智能光照培养箱,金坛市瑞华实验仪器厂；DYY-7C型电泳仪,北京市六一仪器厂；CX31-RBSFA型生物显微镜,上海通灏光电科技有限公司；Tanon3500核酸凝胶成像系统,上海天能科技有限公司.

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌的分离与鉴定 本试验中病原菌的分离主要采用组织分离法[16].主要操作步骤如下：①取表现出明显症状的小麦茎基部,在无菌条件下,将病健交界处剪成大小约为3 mm2的小块；②分别用5%的次氯酸钠溶液和70%的乙醇溶液对上述病块组织润洗1 min；③将洗消后的冰块组织用无菌水冲洗3次,然后再将其置于灭菌滤纸上于超净台内晾干后将其用无菌的镊子转移到PDA培养基的中央,于22℃的普通光照培养箱中倒置培养.

同时,将新鲜菌块进行微观形态观察,并按照Duan等[17]的方法将上述新鲜菌块接种到绿豆汤培养基中在温度为22℃转速为120 r/min的恒温摇床上进行孢子培养,3 d后观察孢子形态.

1.2.2 分子鉴定 采用罗中钦等[18]的方法制备模板DNA,然后用通用引物ITS1TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）（上海生工生物工程股份有限公司）来扩增目标片段,按照实验室常规PCR反应的体系来进行目标片段的扩增（50.0 μL的反应体系：引物I质量浓度为2.0 μg/mL,引物II质量浓度为 2.0 μg/mL,模板质量浓度为 5.0 μg/mL,2×ES taq master mix质量浓度为 25.0 μg/mL,ddH2O补余）,运用如下程序（94℃2 min/94℃30 s,55℃30 s 72℃1 min（循环30次）/72℃10 min,4℃保存即可）对供试病原菌rDNA-ITS进行PCR扩增.PCR产物用质量分数为1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测,并将检测后有明显单一条带的PCR产物送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序,并对反馈的测序结果用DNAMAN软件进行初步分析后,将其和GeneBank中下载的相关序列进行比对、分析,确定病原菌的种类.

1.2.3 杀菌剂的室内毒力测定 试验中所涉及到的杀菌剂毒力测定采用室内生长速率法进行[19].在无菌工作台上将预先配制好的杀菌剂母液（多菌灵用浓度为0.1 mmol/L的HCl溶解,其余的原药均用丙酮溶解）分别稀释成0.006 25,0.012 50,0.025 00,0.050 00,0.100 00,0.200 00,0.400 00和0.800 00 μg/mL质量浓度梯度溶液,其中多菌灵和腐霉利稀释成0.012 5,0.025 0,0.050 0,0.100 0,0.200 0,0.400 0,0.800 0和1.600 0 μg/mL质量浓度梯度溶液；咪鲜胺稀释成0.000 781,0.001 560,0.003 125,0.006 250,0.012 50,0.025 000,0.050 000和0.100 000 μg/mL质量浓度梯度溶液,用加入相应体积无菌水的PDA培养基作为空白对照,配制成含一系列浓度梯度杀菌剂的PDA培养基平板.然后将直径为6 mm的新鲜菌饼接种在每个平板的中央,后将其转移到23℃培养箱内培养,每个处理至少设置3次以上重复.培养48 h后采用十字交叉法测量上述各培养皿中菌落的直径,并取其平均值.利用DPS软件按照生长抑制率公式求出各个药剂的EC50值及毒力回归方程.

2 结果与分析

2.1 病原菌分离结果形态分析

对采用组织分离法分离出的病原菌进行显微镜分析,其结果如图1所示.

图1 小麦茎基腐病原菌菌丝（A）、分生孢子（B）及菌落（C和D）形态图Fig.1 Morphologies of mycelia（A）,conidial（B）and colonies（C and D）of the wheat crown rot

图1结果表明：该病原菌菌丝直立密集且呈白色,中央的菌丝为黄色,且可产黄色色素；分生孢子一般为大型分生孢子,呈镰刀型,具2～5个隔膜,单胞大小为39.1～56.0 μm.

2.2 病原菌rDNA-ITS序列的扩增与序列分析

通过用常规PCR技术对小麦茎基腐病菌的rDNA-ITS序列进行扩增,然后对所得PCR产物用质量分数为1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测后,经过凝胶成像系统观察,小麦茎基腐病菌PCR扩增产物的电泳胶图如图2所示.

图2 通用引物ITS1/ITS4对小麦茎基腐病菌PCR扩增产物的电泳胶图Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification products of the wheat crown rot with the common ITS1/ITS4 primers

由图2结果可以看出,供试样品中有一条明亮的条带,然后取25 μL的PCR产物送至公司测序,得到了一条521 bp的DNA片段.在将上述获得的DNA片段上载到NCBI（National Center for Biotechnology nformation,NCBI）数据库中进行BLAST比对,结果表明该菌株的rDNA-ITS序列与已报道的Fusarium pseudograminearum菌株（ID：MH333075.1）的序列高度相似,序列相似性为99.02%,属于无性真菌类镰孢属成员.

2.3 对13种杀菌剂的敏感性测定结果

本研究通过菌丝生长速率法测定了13种杀菌剂对假禾谷镰刀菌的室内毒力,其测定结果如表2所示.

表2 13种杀菌剂对假禾谷镰刀菌的室内毒力Tab.2 Laboratory virulence determination of 13 fungicides against F.pseudograminearum

从表2结果可以看出,多菌灵和腐霉利的EC50值最高,其EC50值质量浓度分别为1.32和1.15 μg/mL,表明小麦茎基腐病菌已经对上述两种杀菌剂不敏感,即使用常规剂量的腐霉利和多菌灵来防控小麦茎基腐病已存在一定的风险；而其它11种杀菌剂对假禾谷镰刀菌均具有较高的抑菌活性,其EC50值质量浓度分布在0.03～0.97 μg/mL之间,其中,咯菌腈对该病原菌的抑菌活性最高（质量浓度为0.03 μg/mL）,嘧菌酯的抑菌活性相对较弱（质量浓度为0.97 μg/mL）.经过对所得结果进行比较,供试杀菌剂对该病原菌的抑菌活性按照活性由高到低的顺序依次为：咯菌腈＞咪鲜胺＞戊唑醇＞嘧菌环胺＞苯醚甲环唑＞啶酰菌胺＞氟碇胺＞吡唑醚菌酯＞氟吡菌酰胺＞醚菌酯＞嘧菌酯＞多菌灵＞腐霉利.

检测结果表明上述13杀菌剂均可以作为对小麦茎基腐病化学防治的候选杀菌剂,但是使用常规剂量的腐霉利和多菌灵来对其防控时存在较大的风险.

3 结论与讨论

为了进一步明确河南省新乡市红旗区小麦茎基腐病的优势菌源,研究对所分离到的病原菌开展了rDNA-ITS的分子鉴定研究,通过与NCBI数据库中的已有结果进行比对发现,本研究所分离到的小麦茎基腐病的病原为F.pseudograminearum,与已报道菌株（ID：MH333075.1）的序列高度相似,序列相似性高达99.02%.即侵染小麦造成河南省新乡市红旗区的小麦茎基腐病的优势病原为F.pseudograminearum,与已报道的豫北地区小麦茎基腐病的病原一致[20].

目前,对小麦茎基腐病的化学药剂防治虽已有报道,但是研究结果主要集中在几种常见的杀菌剂上[21],尚不能系统地评估目前已有杀菌剂对小麦茎基腐病的抑菌情况.研究通过室内分离得到了小麦茎基腐病的病原为F.pseudograminearum,并通过菌丝生长速率法测定了13种杀菌剂对F.pseudograminearum的毒力,结果表明：除了F.pseudograminearum对苯并咪唑类杀菌剂多菌灵（EC50质量浓度为1.15 μg/mL）和二甲酰亚胺类杀菌剂腐霉利（EC50质量浓度为1.32 μg/mL）呈现敏感性降低的现象外,其他11种杀菌剂均对F.pseudograminearum均具有较高的活性,EC50值质量浓度分布在0.03～0.97 μg/mL之间,其按照活性高低的顺序依次为咯菌腈＞咪鲜胺＞戊唑醇＞嘧菌环胺＞苯醚甲环唑＞啶酰菌胺＞氟碇胺＞吡唑醚菌酯＞氟吡菌酰胺＞醚菌酯＞嘧菌酯＞多菌灵＞腐霉利.进一步表明除了使用常规剂量的腐霉利和多菌灵来对其防控时存在一定的风险外,其它11种杀菌剂均可作为小麦茎基腐病化学药剂防治的候备用杀菌剂；同时,因上述杀菌剂对小麦茎基腐病均具有较好的活性,故在小麦茎基腐病及由F.pseudograminearum引起的病害发生期间施用上述11种杀菌剂均能够有效的对其进行防控,对小麦、玉米等作物的丰产和丰收具有重要的意义.