健脾祛湿膏对大鼠胃肠功能的调节作用

张毅靖 甘剑峰 王永福何国栋吴映秀唐洪梅

（1.广州中医药大学第一临床医学院，广东广州 510405；2.广州中医药大学岭南医学研究中心，广东广州 510405；3.广州中医药大学第一附属医院，广东广州 510405）

岭南地区春夏季气温高，且多雨多湿；夏季广东地区居民有饮凉茶的习惯，更易伤及脾气，因此岭南地区脾虚证多发［1］。脾虚临床表现为蜷缩倦怠、便溏腹泻、消瘦乏力等。研究表明，脾虚患者的胃肠动力和吸收能力较弱，胃肠激素也存在异常［2］。

健脾祛湿膏为广州中医药大学第一附属医院的院内制剂，临床上广泛用于脾虚证，效果显著，但具体机制尚不明确。本实验采用苦寒泻下法结合劳倦过度法复制脾虚腹泻大鼠模型，以血中胃动素（motilin，MTL）、血管活性肠肽（vasocative intestinal peptide，VIP）和生长抑制素（somatostain，SS）、结肠及肾脏水通道蛋白（aquaporin，AQP）、结肠闭锁蛋白occludin 和连接蛋白Claudin-1 的水平为研究指标，探究健脾祛湿膏对大鼠胃肠功能的影响。

1 材料

1.1 动物 4 周龄健康雄性SD 大鼠40 只，SPF 级，体质量约90 g，购于广东省医学实验动物中心，实验动物生产许可证号SCXK（粤）2018-0002，实验动物伦理号TCMF1-2019045。全部大鼠饲养于广州中医药大学第一附属医院SPF 级动物实验中心，实验动物使用许可证号SYXK（粤）2018-0092，昼夜节律为12 h／12 h，环境温度（24±2）℃，相对湿度55%～68%，自由进食进水。

1.2 试剂与药物 健脾祛湿膏（由广州中医药大学第一附属医院膏方室提供，经广州中医药大学第一附属医院药检室检测为合格制剂，批号20190808）；参苓白术散颗粒（山西华康药业股份有限公司，国药准字Z14020399，批号20190103）。番泻叶（广州至信药业股份有限公司，批号190501）由广州中医药大学第一附属医院药检室何嘉仑中药师鉴定为正品。大鼠胃动素（MTL）ELISA 试剂盒（武汉华美生物工程有限公司，批号M06014790）；大鼠血管活性肽（VIP）ELISA 试剂盒［伊艾博（武汉）科技股份有限公司，批号9J126M］；大鼠生长抑制素（SS）ELISA 试剂盒 ［伊艾博（武汉）科技股份有限公司，批号9J126M］；D-木糖水平测试试剂盒（北极索莱宝科技有限公司，批号BC4395）；活性炭（上海易恩化学技术有限公司，批号R019802）；BCA 蛋白浓度测试试剂盒（碧云天生物科技有限公司，批号080919190917）；苏木素伊红染色剂（北京雷根生物科技有限公司，批号1009A19）；D-（+）-木糖（上海源叶生物科技有限公司，批号D19N9S75493）。ECL 化学发光底物（美国Millipore 公司，批号WBKLS0500）；RIPA 裂解液（批号P0013B）、苯甲基磺酰氟（PMSF）（批号ST506）、一抗稀释液，批号（P0256）、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G（H+L）（批号A0280）均购自碧云天生物科技有限公司；Occludin 抗体（美国Abcam 公司，批号RA20770）；Claudin-1 抗体（美国CST 公司，批号#4933）。

1.3 仪器 AL1240 型电子天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；BGE-140 电热鼓风干燥箱（博迅实业有限公司医疗设备厂）；MagNa Lyser 匀浆仪［罗氏诊断产品（上海）有限公司］；ZD-85 型气浴恒温振荡器（常州金坛精达仪器制造有限公司）；5810R 台式高速大容量离心机（德国Eppendorf 公司）；1510 型全波长酶标仪（美国Thermo 公司）；H-7500 型透射电子显微镜（日本Hitachi 公司）。ChemiDoc MP 型全能型凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；165-8001 型垂直板电泳槽（美国Bio-Rad 公司）；TS-2 型水平摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）。

2 方法

2.1 药液制备

2.1.1 番泻叶水液 称取番泻叶适量，加纯化水室温下浸泡30 min，加热至沸腾后继续加热10 min。过滤后浓缩，使药物质量浓度为1.2 g／mL，于4 ℃冰箱中保存［3］。

2.1.2 健脾祛湿膏药液 称取健脾祛湿膏42 g，加入200 mL纯化水，搅拌至溶解，使药液质量浓度为0.21 g／mL，于4 ℃冰箱中保存，每次灌胃前用温水隔水加热至室温，用毕放回冰箱。

2.1.3 参苓白术散药液 称取参苓白术散100 g，加入200 mL纯化水，搅拌至溶解，使药液质量浓度为0.5 g／mL，于4 ℃冰箱中保存，每次灌胃前用温水隔水加热至室温，用毕放回冰箱。

2.2 模型建立 40 只大鼠随机分为空白组、模型组、健脾祛湿膏组（简称“膏方组”）和阳性药参苓白术散组（简称“阳性药组”），每组10 只，适应性饲养3 d，第4天记录各组大鼠体质量，为正式实验第1 天。自正式实验第1 天起，除空白组外其余大鼠每日上午给予冰番泻叶水煎液灌胃1 次，给药剂量为10 mL／kg。除空白组外，各组大鼠晚上置于水桶中游泳1 次至力竭，标志为大鼠入水后不再挣扎游动，鼻尖沉入水中5 s，无法浮出水面。造模持续14 d，实验第15 天进行模型评价，挑选造模成功的大鼠给药［3］。

2.3 给药 实验第15 天起，膏方组按照2.1 g／kg 的临床等效剂量给药，阳性组按5 g／kg 的临床等效剂量给药，空白组给予一定剂量的纯化水灌胃，持续给药14 d。

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2.4 取材 分别于造模结束后和给药结束后1 d，各组大鼠禁食不禁水12 h，手指轻按大鼠腹部刺激排便，收集粪便。禁食结束后给予大鼠一定量D-木糖溶液，代谢笼收集5 h 尿液。实验第30 天取材，配制新鲜的碳末混悬液，每只大鼠定量给予2 mL 碳末混悬液，记录碳末混悬液和注射器的总质量，计算每只大鼠实际灌服的碳末质量，并根据公式胃内残留率＝ ［（含碳末的胃全重-洗净后的胃净重）／（2 mL 碳末与注射器总质量-空白注射器质量）］×100%进行计算。15 min后，大鼠腹腔注射10% 水合氯醛，麻醉，解剖取腹主动脉血，分别用抗凝管和非抗凝管收集；取胃、由幽门到盲部的消化管和肾脏，测量碳末推进长度和小肠总长度，测量完毕后剪取结肠，沿肠系膜纵轴剪开，生理盐水洗净内容物，一部分保存于4%多聚甲醛中，另一部分保存于1.5 mL 离心管，先于冰中保存；称量胃全重，剪开胃后用生理盐水洗净内容物，再次称得胃净重，分别置于冰中冻存。腹主动脉血静置30 min 后离心15 min（3 500 r／min），取血清和血浆，大鼠尿液离心15 min（3 500 r／min）后取上清液。所有样品后期均转移至-80 ℃冰箱。

2.5 指标检测 取大鼠血清和血浆，ELISA 法检测血清SS及血浆MTL、VIP 水平。肾脏和结肠分别加适量PBS 缓冲液后在冰上匀浆，BCA 蛋白试剂盒定量检测总蛋白浓度，ELISA 法检测肾脏匀浆液中AQP2 和结肠匀浆液AQP3 水平。取各组大鼠尿液上清液，根据试剂盒说明书操作，计算D-木糖排泄率。参照HE 染色法制备结肠石蜡切片，包括梯度乙醇脱水、浸蜡、包埋、切片、染色等步骤，切片后光学显微镜观察结肠形态。

2.6 统计学分析 通过SPSS 21.0 软件进行处理，计量资料以（）表示，数据若服从正态分布且方差齐性，则采用单因素方差分析，否则采用非参数检验。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 一般状态 冰番泻叶水煎液结合过度游泳14 d 后，模型组、膏方组、阳性药组大鼠均出现体质量增长缓慢、皮毛光泽黯淡且凌乱、喜好扎堆、大便稀溏等情形，提示脾虚腹泻模型复制成功。

3.2 粪便含水量 采用烘干法测定。如表1 所示，模型组、膏方组和阳性药组大鼠粪便含水量较空白组升高（P＜0.01）；药物干预后，膏方组、阳性药组大鼠粪便含水量较模型组降低（P＜0.05）。

表1 健脾祛湿方对大鼠粪便含水率的影响（， n＝10）

表1 健脾祛湿方对大鼠粪便含水率的影响（， n＝10）

注：与空白组比较，∗∗P＜0. 01；与模型组比较，#P＜0.05。

3.3D-木糖排泄率 如表2 所示，模型组、膏方组、阳性药组大鼠D-木糖排泄率均低于空白组（P＜0.01）；药物干预后，给药组大鼠D-木糖排泄率较模型组升高（P＜0.05）。

表2 健脾祛湿方对大鼠D-木糖排泄率的影响（，n＝10）

表2 健脾祛湿方对大鼠D-木糖排泄率的影响（，n＝10）

注：与空白组比较，∗∗P＜0. 01；与模型组比较，#P＜0.05。

3.4 结肠状态 如图1 所示，HE 染色后可见杯状细胞、腺体和黏膜层表层；各组大鼠结肠黏膜层细胞排列整齐，表层均无明显水肿；空白组大鼠腺体无明显萎缩；模型组大鼠固有层腺体出现较明显的萎缩；药物干预后，给药组大鼠结肠固有层腺体萎缩有所改善。

图1 各组大鼠结肠形态（×100）

表3 健脾祛湿方对大鼠胃内残留率和小肠推进率的影响（， n＝10）

表3 健脾祛湿方对大鼠胃内残留率和小肠推进率的影响（， n＝10）

注：与空白组比较，∗∗P ＜0. 01；与模型组比较，# P ＜0.05，##P＜0.01。

3.6 胃肠激素水平 如表4 所示，与空白组比较，模型组大鼠血浆VIP、血清SS 水平升高（P＜0.01），血浆MTL 水平降低（P＜0.01）；药物干预后，与模型组比较，给药组大鼠血浆MTL 水平升高（P＜0.05），血清SS、血浆VIP 水平降低（P＜0.05）。

表4 健脾祛湿方对大鼠胃肠激素水平的影响（， n＝10）

表4 健脾祛湿方对大鼠胃肠激素水平的影响（， n＝10）

注：与空白组比较，∗∗P＜0. 01；与模型组比较，#P＜0.05。

3.7 结肠AQP3、肾脏AQP2 水平 如表5 所示，与空白组比较，模型组大鼠肾脏AQP2 水平升高（P＜0.01），结肠AQP3 水平降低（P＜0.01）；药物干预后，与模型组比较，给药组大鼠结肠AQP3 水平升高（P＜0.05），肾脏AQP2 水平降低（P＜0.05）。

表5 健脾祛湿方对大鼠结肠AQP3、肾脏AQP2 水平的影响（， n＝10）

表5 健脾祛湿方对大鼠结肠AQP3、肾脏AQP2 水平的影响（， n＝10）

注：与空白组比较，∗∗P＜0. 01；与模型组比较，#P＜0.05。

3.8 结肠Occludin、Claudin-1 蛋白表达 如表6、图2 所示，与空白组比较，模型组大鼠结肠Occludin、Claudin-1蛋白表达降低（P＜0.05）；药物干预后，与模型组比较，给药组大鼠结肠Occludin、Claudin-1 蛋白表达升高（P＜0.05）。

表6 健脾祛湿方对大鼠结肠Occludin、Claudin-1 蛋白表达的影响（， n＝10）

表6 健脾祛湿方对大鼠结肠Occludin、Claudin-1 蛋白表达的影响（， n＝10）

注：与空白组比较，∗P＜0. 05；与模型组比较，#P＜0.05。

图2 各组大鼠结肠Occludin、Claudin-1 蛋白表达

4 讨论

健脾祛湿膏为广州中医药大学第一附属医院院内制剂，由白术、黄连、五指毛桃、何首乌、白芍、柴胡、黑枣等多味药材组成。制备工艺遵照《医疗机构岭南膏方的制备与合理使用专家共识》，首先将各饮片置于煎药机中，加入8 倍量的水浸泡过夜，煎煮提取两次后浓缩而成。参苓白术散方为临床上常用于治疗脾虚湿盛泄泻，关于参苓白术散的相关研究也较为深入［4-5］。因此本实验选参苓白术散作为阳性对照药。

MTL 是一种多肽类胃肠激素，能促进胃肠运动和刺激胃蛋白酶分泌，加速胃对内容物的排出，可促进胃容积的恢复［6］。SS 为生长抑制素，可减弱胃肠运动，减缓胃排空［7］。VIP 为抑制性脑肠肽，可直接作用于胃平滑肌上的受体，使平滑肌和括约肌舒张，抑制小肠的运动，使胃肠运动减弱［8］。与空白组对比，模型组MTL 水平显著降低而VIP 和SS 水平显著升高，提示模型大鼠胃肠运动减弱，导致胃内残留率升高而小肠推进率降低。此外，VIP 显著升高，导致模型大鼠括约肌异常舒张，胃肠下行运动亢奋，使肠道内容物停留时间减少，肠道对于内容物水分重吸收不充分，导致模型大鼠粪便含水量异常增多。

D-木糖主要在空肠上段被吸收，不能为肝脏利用，大部分经由肾脏从尿液中排出，尿液中木糖排泄率可反应小肠吸收能力，是目前临床脾虚证的常用诊断指标之一［9］。造模结束后，除空白组外各组大鼠D-木糖排泄率显著降低，提示模型复制成功。药物干预后，给药组大鼠D-木糖排泄率显著上升，提示其肠道吸收功能有所改善。

水通道蛋白AQP3 主要在消化道中表达，主要调节消化道的水分重吸收功能，直接影响消化道对水的重吸收功能。结肠AQP3 表达过低会影响结肠对内容物或粪便水分的重吸收，粪便含水量过高从而导致腹泻［10］。AQP2 主要分布于肾脏中，调节肾脏对原尿水分的重吸收功能［11］。本实验中，模型组大鼠结肠AQP3 水平显著降低，表明其结肠水分重吸收功能异常。实验中收集大鼠尿液时发现经造模干预的鼠尿量较空白组少，经过给药干预后，膏方组和阳性药组大鼠尿量有所上升，但仍较空白组低，且组内尿量差异大，猜测可能是由于粪便含水量上升，大鼠自身为达到机体水液平衡做出的调整。实验结果也表明模型组大鼠的肾脏AQP2 水平显著升高，表明其肾脏对水的重吸收作用加强，因此导致尿量较少。经药物干预后，给药组肾脏AQP2 水平降低，结肠AQP3 水平上升。本实验初步从机体水盐代谢角度探究膏方对大鼠模型的治疗作用，仅仅用ELISA 法对比各组大鼠结肠AQP3 和肾脏AQP2 的数量差异，较为片面，结果也存在较大误差，是本实验的不足之处。

Occludin 和Claudin-1 均是肠屏障结构的重要紧密连接蛋白，功能为维持上皮细胞结构，控制相关离子的转运，维持和调节肠道通透性［12］。实验中模型组大鼠结肠Occludin 和Claudin-1 蛋白水平降低，肠道通透性增加，可能是导致粪便含水量上升的主要原因，经药物干预后，膏方组大鼠结肠Occludin 和Claudin-1 蛋白水平有所上升。

实验中模型大鼠胃肠激素、水通道蛋白和结肠Occludin 和Claudin-1 蛋白表达结果和文献报道一致，经药物干预后，健脾祛湿膏组大鼠各项指标有所改善，提示健脾祛湿膏可能是通过上调MTL 水平，同时下调SS 和VIP水平，改善脾虚腹泻大鼠的胃肠运动和吸收能力，同时上调结肠AQP3、Occludin 和Claudin-1 蛋白水平，下调肾脏AQP2 水平，改善肠道的通透性和对水的重吸收能力，调整机体水盐平衡，缓解腹泻症状，进而实现疗效。