仙灵骨葆胶囊对去卵巢骨折大鼠骨折端骨微结构的影响及OPG／RANKL 信号调控机制

任世元，张琦豪，闫晓哲

（郑州市骨科医院，河南郑州 450052）

骨质疏松性骨折在绝经后女性中较为常见，由于患者骨量减少，使得内固定失败或断骨愈合不全，导致治疗效果不佳［1］。骨折愈合早期患者断肢不负重，骨断面骨组织转化率高，从而在骨骼愈合过程中易出现骨痂分解代谢，无法形成骨桥，最终导致骨折不愈合［2］，使患者行动能力受限，给其家庭带来沉重负担，故减少骨折不愈合为骨折治疗的关键。目前，促进骨形成、抑制骨吸收的主要药物为二磷酸盐类，但其长期服用时会增加下颌骨坏死、非典型性骨折的风险［3］。

仙灵骨葆胶囊由淫羊藿、续断、丹参、知母、补骨脂、地黄组成，具有滋补肝肾、活血化瘀、强筋壮骨的功效，可抑制破骨细胞骨吸收，促进骨基质重建和骨折愈合［4］。骨保护素（osteoprotegerin，OPG）／核因子κB 受体活化因子配基（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）信号通路在破骨细胞的分化与成熟过程中起到至关重要的调控作用，RANKL 表达增多会使成骨细胞向破骨细胞转化，促进破骨细胞活性和骨吸收，最终导致骨折不愈合［5］。因此，本实验选择去卵巢大鼠股骨骨折内固定模型，探讨仙灵骨葆胶囊对其骨折端骨微结构的影响，并基于OPG／RANKL 信号通路分析其作用机制。

1 材料

无特性病原体SPF 级雌性Sprague-Dawley 大鼠，3 月龄，体质量200～220 g，购于北京安凯毅博生物技术有限公司，动物生产许可证号SCXK（京）2017-0006，适应性饲养1 周后进行实验。

戊酸雌二醇（白色固体片剂）购于拜耳医药保健有限公司广州分公司（国药准字J20130009）；仙灵骨葆胶囊（硬胶囊，内容物为褐色颗粒状粉末）购于国药集团同济堂贵州制药有限公司（国药准字Z20025337）；水合氯醛购于青岛宇龙海藻有限公司（国药准字H37022673）；大鼠血清骨碱性磷酸酶（bone alkaline phosphatase，BALP）、骨钙素（osteocalcin，OC）酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒购于上海酶联生物科技有限公司（批号P201607、P201509）；苏木精-伊红（hematoxylineosin，HE）染色试剂盒购于上海剑钝生物科技有限公司（批号113697）；蛋白免疫印迹（Western blot，WB）试剂盒购于上海恒斐生物科技有限公司（批号P201703）；蛋白提取试剂盒、核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）提取试剂盒、反转录试剂盒均购于北京奥维亚生物技术有限公司（批号1839271）；OPG、RANKL 一抗购于美国R＆D 公司（批号E201 801 A）；辣根过氧化物酶标记二抗购于美国Sigma 公司；引物合成委托杭州联科美讯生物医药技术有限公司（批号1159241）；实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）试剂盒购于北京天根生化科技有限公司（批号P201507）。

InAlyzer 双能X 线骨密度仪购于韩国Medikors公司；TGL-20M 高速台式离心机购于上海卢湘仪离心机仪器有限公司；KH-Q2016 组织切片机购于湖北孝感阔海医疗科技有限公司；WMS-9950 生物显微镜购于上海无陌光学仪器有限公司；Powerpac HV 电泳仪购于美国伯乐公司；SynergTM NEO2 酶标仪购于美国Bio-Tek 公司；克氏针、咬骨钳和骨锯均购于盐城瑞奥科技有限公司。

2 方法

2.1 建模、分组与给药 从48 只大鼠中随机挑选40 只，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后切除双侧卵巢；其余8 只仅暴露卵巢组织，不进行切除，术后进行为期6 周的恢复性饲养。6 周后去势大鼠建立股骨骨折内固定模型，方法为大鼠麻醉后仰卧在无菌操作台上，暴露左侧股骨和髌韧带，打开关节腔，将1.0 mm 克氏针从股骨近端沿股骨长轴方向钻入，并确保其固定于髓内松质骨中，小电锯锯断股骨中段；其余8 只正常大鼠仅暴露左侧股骨和髌韧带，不进行克氏针刺入和股骨锯断。将40 只建模大鼠随机分为模型组、阳性对照组及仙灵骨葆胶囊高、中、低剂量组，其中8 只正常大鼠作为正常组，模型组、正常组大鼠以生理盐水灌胃，每天1 次；将戊酸雌二醇溶于生理盐水中，使其质量浓度为0.018 mg／mL，并以10 mL／kg 剂量灌胃给予阳性对照组大鼠，每天1 次，每6 d 停药1 d；将100、50、25 mg／kg 仙灵骨葆胶囊内容物粉末溶于2 mL 生理盐水中，分别灌胃给予仙灵骨葆胶囊高、中、低剂量组大鼠，每天1 次。各组均给药10 周。

2.2 骨折愈合时间比较 以骨折线消失或接近消失为骨折愈合标准，记录每只大鼠骨折愈合时间，取平均值。

2.3 大鼠血清BALP、OC 水平检测 治疗10 周后，采集大鼠尾静脉血，室温下静置2 h 后离心分离血清。将样品血清加入已包被的96 孔板中，按照ELISA 试剂盒说明书进行操作，加入终止液显色后立即放入酶标仪中读取光密度值，绘制标准曲线，计算样品浓度。

2.4 大鼠骨折部位骨密度测定 治疗10 周后，颈椎脱臼法处死大鼠，拔出建模大鼠左侧股骨克氏针，双能X 线扫描仪扫描左侧股骨骨折部位，骨折线置于中央处，扫描完成后采用配套软件分析系统测定其骨密度；正常大鼠则扫描左侧股骨中段。

2.5 大鼠骨折部位骨微结构观察 取建模大鼠骨折处骨组织、正常大鼠左侧股骨中段骨组织，按照HE 染色试剂盒说明书对大鼠骨组织样品进行切片、染色、封片，在光镜下观察骨微结构。

2.6 骨折处骨组织OPG、RANKLmRNA 表达检测 取大鼠骨组织10 mg，加入液氮研磨匀浆，RNA提取试剂盒提取总RNA，反转录试剂盒将其反转录为互补脱氧核糖核酸（complementary DNA，cDNA），按照美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）上提供的目的基因mRNA 序列设计出上下游引物，OPG正向5′-TGATCCGTATAGGCTGTAAGG-3′，反向 5′-GGTTATGCCAACACTGAGTG-3′，产物长度 115 bp；RANKL正向 5′-AGGCTGCTGAAGCTGATAGG-3′，反向5′-TGAGACCTCTCAAGCTAACG-3′，产物长度130 bp；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）正向 5′-TCCGATGCATTAGATACCGA-3′，反向5′-TGAACGCTCAGATGGAACTA-3′，产物长度135 bp。qRT-PCR反应条件按照试剂盒说明书设置，根据配套荧光采集系统对样品溶解曲线进行分析，GAPDH作为持家基因，计算各目的基因mRNA 相对表达量。

2.7 骨折处骨组织OPG、RANKL 蛋白表达检测 取大鼠骨组织10 mg，加入液氮、细胞裂解液研磨匀浆，提取总蛋白，加入蛋白上样缓冲液，按照Western blot 试剂盒说明书配置电泳凝胶，每孔加入30 μL 样品进行凝胶电泳，将蛋白转至聚偏二氟乙烯（poly vinylidene fluoride，PVDF）膜上，5%脱脂牛奶4 ℃下封闭过夜、按照1∶1 000 比例稀释加入一抗，室温下孵育2 h，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）清洗2 次后，按照1∶1 000 比例稀释加入二抗，化学发光液在暗室中显色，图像分析系统对显色条带灰度值进行分析，以GAPDH 为内参。

2.8 统计学分析 通过SPSS 20.0 软件进行处理，计量资料以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，2 组间比较采用SNK-q检验。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠骨折愈合时间 建模过程中出现1 只大鼠死亡，可能与过度麻醉有关。分组情况为正常组8 只、模型组7 只、阳性对照组及仙灵骨葆胶囊高、中、低剂量组各8 只。实验过程中，未出现大鼠伤口感染。

各组大鼠骨折愈合时间分别为模型组（8.58±0.14）周、阳性对照组（7.50±0.43）周、仙灵骨葆胶囊高剂量组（6.00±0.51）周、仙灵骨葆胶囊中剂量组（6.50±0.25）周、仙灵骨葆胶囊低剂量组（7.75±0.19）周，即阳性对照组、仙灵骨葆胶囊各剂量组均短于模型组（P＜0.05），并呈剂量依赖性。

3.2 大鼠血清BALP、OC、s-CTX 水平 模型组大鼠血清BALP、OC 水平低于正常组（P＜0.05），阳性对照组、仙灵骨葆胶囊各剂量组均高于模型组（P＜0.05），并呈剂量依赖性；模型组大鼠血清s-CTX水平高于正常组（P＜0.05），阳性对照组、仙灵骨葆胶囊各剂量组均低于模型组（P＜0.05），并呈剂量依赖性。见表1。

表1 各组大鼠血清BALP、OC、s-CTX 水平（）Tab.1 Serum BALP，OC and s-CTX levels in rats in various groups（）

表1 各组大鼠血清BALP、OC、s-CTX 水平（）Tab.1 Serum BALP，OC and s-CTX levels in rats in various groups（）

注：与正常组比较，#P＜0. 05；与模型组比较，∗P＜0.05。

3.3 大鼠股骨骨折处骨密度 模型组大鼠股骨骨折处骨密度低于正常组（P＜0.05），阳性对照组、仙灵骨葆胶囊各剂量组均高于模型组（P＜0.05），并呈剂量依赖性。见表2。

表2 各组大鼠股骨骨折处骨密度（）Tab．2 Bone mineral densities of femoral fractures in rats in various groups （）

表2 各组大鼠股骨骨折处骨密度（）Tab．2 Bone mineral densities of femoral fractures in rats in various groups （）

注：与正常组比较，#P＜0. 05；与模型组比较，∗P＜0.05。

组别动物数／只骨密度／（mg·cm-2）正常组8136.48±3.75模型组7102.66±4.11#阳性对照组8114.28±2.92∗仙灵骨葆胶囊高剂量组8131.75±3.14∗仙灵骨葆胶囊中剂量组8125.40±3.58∗仙灵骨葆胶囊低剂量组8115.71±2.28∗

3.4 大鼠骨折处股骨微结构 正常组大鼠骨小梁分布正常均匀，排列紧密；模型组大鼠骨组织向板层骨发展，骨小梁、髓腔较少；阳性对照组、仙灵骨葆胶囊低剂量组大鼠骨小梁增多，成骨细胞数量增加，形成板层状骨；仙灵骨葆胶囊中剂量组大鼠骨小梁数目多于阳性对照组、仙灵骨葆胶囊低剂量组，分布均匀；仙灵骨葆胶囊高剂量组大鼠骨小梁分布均匀，数量较多，可见较明显髓腔再通。见图1。

3.5 大鼠股骨骨折处骨组织OPG、RANKLmRNA表达 模型组大鼠骨折处骨组织OPGmRNA 表达低于正常组（P＜0.05），阳性对照组、仙灵骨葆胶囊各剂量组均高于模型组（P＜0.05），并呈剂量依赖性；模型组大鼠股骨骨折处骨组织RANKLmRNA 表达高于正常组（P＜0.05），阳性对照组、仙灵骨葆胶囊各剂量组均低于模型组（P＜0.05），并呈剂量依赖性。见表3。

图1 各组大鼠股骨骨折处微结构（HE，×200）Fig.1 Microstructures of femoral fractures in rats in various groups（HE，×200）

表3 各组大鼠股骨骨折处骨组织OPG、 RANKL mRNA表达（）Tab.3 mRNA expressions of OPG and RANKL in the bone tissues of femoral fractures in rats in various groups（）

表3 各组大鼠股骨骨折处骨组织OPG、 RANKL mRNA表达（）Tab.3 mRNA expressions of OPG and RANKL in the bone tissues of femoral fractures in rats in various groups（）

注：与正常组比较，#P＜0. 05；与模型组比较，∗P＜0.05。

3.6 大鼠股骨骨折处骨组织OPG、RANKL 蛋白表达 模型组大鼠股骨骨折处骨组织OPG 蛋白表达低于正常组（P＜0.05），阳性对照组、仙灵骨葆胶囊各剂量组均高于模型组（P＜0.05），并呈剂量依赖性；模型组大鼠股骨骨折处骨组织RANKL 蛋白表达高于正常组（P＜0.05），阳性对照组、仙灵骨葆胶囊各剂量组均低于模型组（P＜0.05），并呈剂量依赖性。见图2、表4。

图2 各组大鼠股骨骨折处骨组织OPG、RANKL 蛋白表达Fig.2 Protein expressions of OPG and RANKL in the bone tissues of femoral fractures in rats in various groups

表4 各组大鼠股骨骨折处骨组织OPG、RANKL 蛋白表达（）Tab.4 Protein expressions of OPG and RANKL in the bone tissues of femoral fractures in rats in various groups（）

表4 各组大鼠股骨骨折处骨组织OPG、RANKL 蛋白表达（）Tab.4 Protein expressions of OPG and RANKL in the bone tissues of femoral fractures in rats in various groups（）

注：与正常组比较，#P＜0. 05；与模型组比较，∗P＜0.05。

4 讨论

老年、绝经后妇女易得骨质疏松症，其特点是骨量丢失、骨微结构改变而易导致骨折［6］，是老年人发生骨折的主要原因，不但导致患者生活质量下降，而且给其带来较高的死亡风险［7］。由于雌激素可抑制破骨细胞的分化与成熟，有利于成骨细胞的生成，故当其缺乏时会导致破骨细胞活性增加而成骨细胞减弱［8］。目前，常用的雌（孕）激素补充治疗虽然可减少骨丢失，降低骨折风险，但也会增加患子宫内膜癌的风险［9］，故开发能促进成骨细胞与破骨细胞平衡的药物是治疗雌激素缺乏导致骨质疏松的关键。

去势大鼠体内雌激素缺乏是骨代谢失衡的重要原因，而本实验发现模型组大鼠骨密度显著低于正常组，表明大鼠去势后雌激素缺乏引起骨量丢失。血清BALP 由成骨细胞分泌，而OC 由成骨细胞分泌，在骨骼的细胞外基质中积累，两者均为骨形成标志物；s-CTX 是破骨细胞分解Ⅰ型胶原的产物，是公认的骨吸收标志物［10］。本实验发现，模型组大鼠血清BALP、OC 水平降低、s-CTX 水平升高，表明雌激素缺乏会导致破骨细胞活性增加，成骨细胞生成受阻［11］，而给药组前两者水平升高，后者水平下降，表明仙灵骨葆胶囊、雌激素均有利于维持成骨细胞和破骨细胞代谢平衡。

调节成骨细胞和破骨细胞动态平衡的关键调节通路是 OPG／RANKL 信号通路［12］，RANK 是RANKL 的特异性受体，两者在破骨细胞表面识别并结合，可促进破骨细胞分化与成熟，并抑制其凋亡，从而导致骨吸收，降低骨密度［13］，同时其结合也可引起破骨细胞标志物s-CTX 水平增加［14］。OPG 主要由成骨细胞和骨髓间质干细胞分泌，对抑制骨吸收、增加骨密度等起到关键作用［15］，可与RANKL 结合而占据后者结合位点，从而竞争性抑制RANK、RANKL 结合，从而达到抑制破骨细胞的分化与成熟的目的［16］。由于成骨、破骨细胞处于动态平衡，故当后者活性受到抑制时前者活性升高，会促进成骨细胞标志物BALP、OC 水平［17-18］。本实验发现，模型组大鼠骨折处骨组织OPGmRNA、蛋白表达低于正常组，而RANKLmRNA、蛋白表达更高，给药后阳性对照组、仙灵骨葆胶囊各剂量组OPG 表达升高，RANKL 表达降低，以高、中剂量组更明显，表明戊酸雌二醇、仙灵骨葆胶囊均可上调OPG 表达，下调RANKL 表达，以高剂量后者效果更优。

综上所述，仙灵骨葆胶囊可减少去卵巢大鼠骨折愈合时间，增加骨折处骨组织骨密度，增加骨折处骨小梁数量，提高BALP、OC 水平，降低s-CTX水平，对去卵巢大鼠骨折愈合具有促进作用，其作用机制可能与提高OPGmRNA、蛋白表达，降低RANKLmRNA、蛋白表达，从而促进抑制破骨细胞活性有关。