三七总皂苷对非酒精性脂肪肝大鼠的改善作用及对NO／iNOS／NF-κB通路的影响

冯晓异，何朋伦，赵 微，姚 政，陈文慧

（云南中医药大学，云南昆明 650500）

非酒精性脂肪肝是一种无过量饮酒史，以肝细胞内甘油三酯蓄积过多、弥漫性肝细胞脂肪变性为主要病理特征的临床综合征［1］，属于代谢应激性肝损伤疾病，发病与胰岛素抵抗、遗传易感性密切相关，炎症因子失衡是关键环节［2］。NF-κB 信号通路是炎症信号转导途径中的主要通路之一，可上调编码炎症介质和细胞因子的促炎基因表达，从而进一步激活诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）等相关酶类及血管细胞黏附分子，炎症反应得以级联放大［3-5］，同时iNOS 的激活进一步释放大量NO，后者是细胞间信息交换的重要载体之一，广泛参与生理功能的调节和病理过程的发生［6-7］。

三七为五加科植物，以干燥根、根茎入药，其味甘、微苦，属云南道地药材，也是活血祛瘀、通脉活络的常用临床用药，在治疗血证，尤其是瘀血方面有“金不换”之称，其主要成分三七总皂苷是关键药效物质［8-10］，具有影响炎性免疫反应的作用［11-13］。本实验在前期研究［14］基础上，进一步探讨在非酒精性脂肪肝病理进展中三七总皂苷对血清转氨酶、血脂生化指标、肝组织中NO 和iNOS 表达的影响，以及对iNOS／NO／NF-κB 通路的调节作用，并分析各项检测指标与非酒精性脂肪肝进展及该成分作用之间的关系，以期为深入研究相关可能机制奠定理论基础。

1 材料

1.1 动物 96 只SPF 级SD 雄性大鼠，体质量（200±20）g，由四川省成都达硕生物有限公司提供，动物生产许可证号SCXK（川）2014-23，饲养于云南中医药大学SPF 实验动物中心。饲养环境符合清洁级动物环境标准，室内安静，自然采光，通风良好，温度湿度保持恒定。

1.2 试剂与药物 三七总皂苷（批号TB20171210，西安天宝生物科技有限公司，纯度＞95%）。0.9%氯化钠溶液（批号SO97A62，中国大家制药有限公司）；高密度脂蛋白检测试剂盒（A112-1，批号20160301）、低密度脂蛋白检测试剂盒（A113-1，批号20160219）、甘油三酯检测试剂盒（A110-1，批号20160525）、总胆固醇检测试剂盒（A111-1，批号20160522）、ALT 检测试剂盒（A009-2，批号 20160622）、AST 检测试剂盒（A010-2，批号20160625）（南京建成生物科技有限公司）；总NO 检测试剂盒（KGE001，批号335566，美国R＆D 公司）；一氧化氮合成酶检测试剂盒（KA1634，批号62316，美国Abnova 公司）；iNOS、NF-κB、p-NF-κB、IKKα、p-IKKα、p-IkBα 抗体（美国Cell Signaling Technology 公司）。

2 方法

2.1 模型建立 采用88%普通饲料加10%猪油、2%胆固醇的高脂饲料喂养SD 大鼠，建立高脂性早期脂肪肝模型，并按非酒精性脂肪肝病诊疗指南（2010 年修订版）病理学诊断标准进行评价。

2.2 分组与给药 96 只大鼠按随机数字表法分为6 组，每组16 只，分别为空白组（普通饲料饲养，生理盐水灌胃给药）、模型组（高脂饲料饲养，生理盐水灌胃给药）、三七总皂苷低剂量组（高脂饲料饲养，4.5 mg／kg 三七总皂苷灌胃给药）、三七总皂苷中剂量组（高脂饲料饲养，9 mg／kg 三七总皂苷灌胃给药）、三七总皂苷高剂量组（高脂饲料饲养，18 mg／kg 三七总皂苷灌胃给药）、⑥辛伐他汀组（高脂饲料饲养，2 mg／kg 辛伐他汀灌胃给药），各组给药容量均为10 mL／kg，每天1 次，连续12 周。于给药第8、12 周末取材（每组8 只），进行相关指标检测，药物水平依据动物实验用药公式计算，即大鼠给药量＝（6.3×每天成人给药量）×大鼠体质量（平均200 g）／成人体质量（60 kg）。

2.3 大鼠肝组织病理形态观察 取材前大鼠禁食不禁水12 h，取材当日迅速打开麻醉后大鼠的胸腔，取出肝组织，于最大叶上取约1 cm3大小置于4%多聚甲醛中保存，制作石蜡切片用于HE 染色，其余肝组织于-80 ℃下保存备用。

2.4 大鼠血清生化指标检测 各组大鼠麻醉后腹主动脉采血，4 ℃下3 000 r／min 离心15 min 后，取上清液，根据罗氏生化分析仪操作步骤检测丙氨酸转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDLC）、低密度脂蛋白（LDL-C）水平。肝组织匀浆后，5 500 r／min 离心15 min，取上清液检测TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平。

2.5 大鼠肝组织NO、iNOS 表达检测 采用ELISA 法。将肝脏置于5 倍量组织匀浆缓冲液（10 倍体积RIPA 裂解液+1／100 体积蛋白酶抑制剂）中，4 ℃下匀浆，匀浆液5 500 r／min 离心15 min，取上清液，按ELISA 试剂盒说明书要求进行检测。

2.6 大鼠肝组织iNOS 相关表达检测 采用免疫组化法。按“2.3”项下方法制备石蜡切片后进行烤片、水化、抗原修复，再滴加iNOS 抗体，DAB 显色，光学显微镜拍照，通过Image J 软件对图片进行iNOS 表达阳性细胞占比计算。

2.7 大鼠肝组织NF-κB 信号通路相关蛋白表达检测 取大鼠肝脏组织约20 mg，按1∶10 比例加入RIPA 强效裂解液，按1∶100 比例加入蛋白酶抑制剂，4 ℃下组织匀浆，匀浆液12 000 r／min 离心10 min，取上清液，BCA 法进行蛋白定量，蛋白变性后取30 μg 进行SDS-PAGE，转膜至NC 膜，4 ℃下孵育一抗过夜，PBST 洗膜后室温下孵育二抗1 h，PBST 洗膜，ECL 显色后在TANON 凝胶成像仪上曝光检测条带，通过Image J 软件进行条带灰度分析。

2.8 统计学分析 通过SPSS 17.0 软件进行处理，计量资料符合正态性以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK 法；不符合正态性，则进行非参数检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 三七总皂苷对大鼠肝组织细胞形态的影响

3.1.1 模型组 给药8 周末，大鼠肝组织每单位面积视野下超过1／3 的肝细胞出现脂肪变性，多数肝细胞内出现脂滴，但尚未融合成大的脂肪空泡，炎症程度较轻。给药12 周末，模型组大鼠肝细胞出现大量脂肪空泡，将细胞核挤向胞膜一侧，大量肝细胞出现明显气球样变，多数视野下肝索结构难以辨认，并伴随明显的炎细胞浸润和肝细胞坏死情况。见图1。

3.1.2 给药组 给药8 周末，辛伐他汀组大鼠未观察到脂肪变性，肝索排列规则，肝小叶结构正常；三七总皂苷高剂量组大鼠偶见个别肝细胞存在脂肪空泡，肝细胞结构、肝索排列、肝小叶结构无明显异常；三七总皂苷中、低剂量组大鼠有散在的肝细胞中出现脂滴的聚集，中剂量组出现脂滴的程度明显少于低剂量组。给药12 周末，辛伐他汀组、正常组大鼠无明显差异，三七总皂苷高剂量组大鼠虽然大部分细胞出现明显的细胞水肿，但脂变、炎症程度都低于中、低剂量组，三七总皂苷低剂量组脂变程度和炎症程度最高。见图1。

图1 第8、12 周各组大鼠肝组织病理形态（HE，10×40）Fig.1 Pathological morphologies of rat liver tissues in various groups in the 8th and 12th weeks（HE，10×40）

3.2 三七总皂苷对大鼠血清ALT、AST、TC、TG、HDL、LDL 水平的影响 给药8 周末，与模型组比较，各给药组大鼠血清ALT、TC、TG、LDL 水平降低（P＜0.05），除三七总皂苷高剂量组外各给药组AST 水平降低（P＜0.05），除辛伐他汀组外各给药组HDL 水平降低（P＜0.05）。给药12 周末，与空白组比较，模型组ALT、AST、LDL 水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组ALT、AST、TC、TG、LDL 水平降低（P＜0.05），除三七总皂苷低剂量组外各给药组HDL 水平无明显变化（P＞0.05）；除空白组外，各组HDL 水平呈下降趋势，以模型组、辛伐他汀组更明显（P＜0.05）；各组LDL 水平呈上升趋势，以模型组更明显（P＜0.01）；与同一时间点模型组比较，各给药组LDL水平降低（P＜0.05）。见图2。

图2 第8、12 周各组大鼠血清生化指标Fig.2 Rat serum biochemical indices in various groups in the 8th and 12th weeks

3.3 三七总皂苷对大鼠肝组织NO、iNOS 表达的影响

3.3.1 NO 表达 给药8 周末，与模型组比较，辛伐他汀组、三七总皂苷各剂量组NO 表达降低（P＜0.01）。给药12 周末，与模型组比较，辛伐他汀组及三七总皂苷中、高剂量组NO 水平降低（P＜0.05）。见图3。

图3 第8、12 周大鼠肝组织NO 表达Fig.3 NO expressions in rat liver tissues in the 8th and 12th weeks

3.3.2 三七总皂苷对大鼠肝组织iNOS 表达的影响 给药8 周末，与模型组比较，辛伐他汀组、三七总皂苷各剂量组iNOS 表达降低（P＜0.05），以三七总皂苷高剂量组更明显（P＜0.01）。给药12 周末，与模型组比较，辛伐他汀组、三七总皂苷各剂量组iNOS 表达降低（P＜0.01）。见图4。

图4 第8、12 周大鼠肝组织iNOS 表达Fig.4 iNOS expressions in rat liver tissues in the 8th and 12th weeks

3.3.3 三七总皂苷对大鼠肝组织iNOS 相对表达的影响 模型组大鼠iNOS 阳性细胞数量从第8 周的（4.89±1.04）% 升高到12 周的（5.57±0.44）%，辛伐他汀组从（0.75±0.03）% 升高到（2.89±1.60）%，三七总皂苷低、中、高剂量组分别从（1.20±0.26）%、（1.69±0.22）%、（2.21±0.28）%升高到（1.40±0.08）%、（1.73±0.51）%、（3.17±0.96）%；与模型组比较，各给药组iNOS 表达降低（P＜0.01）。见图5。

3.4 三七总皂苷对大鼠肝组织NF-κB、p-NF-κB、IKKα、p-IKKα、IkBα 蛋白表达的影响 给药12 周末，与模型组比较，辛伐他汀组、三七总皂苷各剂量组NF-κB 蛋白表达及磷酸化水平降低（P＜0.05）；辛伐他汀组IKKα 蛋白表达及磷酸化水平降低（P＜0.05）；三七总皂苷中、高剂量组IKKα磷酸化水平降低（P＜0.05）；除三七总皂苷低剂量组外，各给药组IκBα 蛋白表达降低（P＜0.05）。见图6。

图5 第8 周、12 周大鼠肝组织iNOS 相对表达Fig.5 iNOS relative expressions in rat liver tissues in the 8th and 12th weeks

图6 第12 周大鼠肝组织NF-κB、IKKα、IκBα 蛋白表达Fig.6 Protein expressions of NF-κB，IKKα and IκBα in rat liver tissues in the 12th weeks

4 讨论

非酒精性脂肪肝是一种代谢应激性肝损伤疾病，包括非酒精性单纯性肝脂肪变、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化、肝细胞癌［15］。中医认为，肝郁脾虚是非酒精性脂肪肝发生基础，痰浊瘀毒则为其主要病理因素，痰湿淤血湿交阻互结，肝脏脉络阻遏，从而形成该疾病，祛痰化瘀是治疗首要目标。三七在治疗血证，尤其是淤血方面的独特作用，让该药材在临床时被广泛使用，对其作用机理的深入阐释将为相关药物的合理使用奠定理论基础。

机体受到来自内部或外部的刺激时，会产生炎症反应，其适度时在一定程度上可起到保护机体的作用，但长期、剧烈的炎症会参与多种疾病的病理进程［16］，诱导产生大量iNOS，可很快从转录水平上调免疫细胞或其他内源免疫反应组织的活性，进一步释放NO［17］，后者与O2-结合后生成一种更强的氧化剂ONOO-，导致自由基反应加剧、细胞损伤。在病理条件下，iNOS 强表达是脏器损伤和加重的重要原因，同时NO 可弥散入细胞抑制三羧酸循环，抑制线粒体呼吸链上某些限速酶，干扰能量代谢，减少ATP 合成，加剧组织损伤。炎症过程中NF-κB 处于活化状态，从而促使炎症基因表达上调，激活iNOS 等相关酶类及血管细胞黏附分子，使炎症反应级联放大，其活化二聚体可易位进入细胞核内与靶基因发生特异性结合，从而调控NO 的生成、细胞因子表达和释放［18-19］。

本实验发现，高脂饲料饲养8 周末模型组大鼠肝脏已产生脂肪代谢障碍，而各给药组未观察到脂肪变性及结构异常，其中三七总皂苷仅中、低剂量新出现脂滴聚集，并体现出一定的量效关系；12 周末，模型组大鼠肝细胞呈现明显的炎细胞浸润和肝细胞坏死情况，而各给药组能显著改善肝细胞的形态，抑制炎性发生，阻止细胞坏死；辛伐他汀、三七总皂苷各剂量组大鼠血清AST、ALT、LDL-C、TC、TG 水平显著下调（P＜0.05），其中大部分指标体现了量效关系；三七总皂苷各剂量组对肝组织NO、iNOS 水平及NF-κB 信号通路相关蛋白表达有调节作用，印证了该成分对非酒精性脂肪肝大鼠炎症相关因子的抑制作用，从而可发挥缓解炎症反应、保护肝脏的活性。

综上所述，在非酒精性脂肪肝的形成及其进展过程中，三七总皂苷可有效降酶降脂，减轻炎症，改善肝脏功能和炎症反应，其机制可能与下调NO／iNOS／NF-κB 信号通路相关蛋白表达有关。