宏基因组二代测序在感染性疾病中的应用进展*

胡晓熠 王惠明

感染性疾病为临床常见疾病，其防治重要性日益凸显，而相关病原体常规检测方法存在周期长，阳性率低等缺点，难以满足临床需求。下一代基因测序(Next Generation Sequencing，NGS)也称高通量测序或大规模并行测序，是一种将数百万甚至数亿条DNA片段同时和独立测序的技术，为感染性疾病的临床防治提供了新的方法，也为公共卫生事件调查和发现新的传染病，以及开发疫苗及研究抗菌药物等提供了技术支持。

NGS技术在临床微生物的检测应用包括全基因组测序、16rRNA基因测序和宏基因组二代测序(Metagenomic Next Generation Sequencing，mNGS)等。mNGS是一种平行检测样本所有核酸(DNA和/或RNA)的方法，可以快速、高效、准确地获得检测样本的基因组信息，从而分析出致病病原体，指导临床诊断和治疗，其潜力和优势已被越来越多的研究所证实[1,2]。本文综述mNGS在细菌、真菌、病毒和寄生虫等感染中的诊断优势和临床应用进展。

1 NGS技术简介

2005年Roche公司率先推出基于微乳液PCR技术的NGS技术，标志着NGS时代的到来[3]。随后众多科研机构和生物公司均相继开展这一技术的研究工作，目前常见的有Roche公司的454测序、Illumina公司的Solexa测序以及ABI公司的SOLID测序[4]。不论是基于乳液PCR技术还是桥式PCR技术的测序方法，本质都是将目标DNA或RNA片段先碎片化，通过对小片段核酸的扩增和精准测序，并与已知参考基因片段进行对比、定位和整合分析，进而通过计算机算法获得目标核酸的完整序列[5]。

2 mNGS检测的临床应用

近年来，许多新发感染不断出现，埃博拉病毒及新型冠状病毒的传播，疑难感染病例的增多，耐多药病原体(产碳青霉烯酶的革兰氏阴性菌)的产生等[6]，传统的检测方法如培养、核酸扩增试验等已很难满足临床需求。mNGS几乎可以检测所有类型的感染性病原体,包括病毒、细菌、真菌、寄生虫、支原体、钩端螺旋体等，甚至可以检测到新的微生物，可以更加低成本、准确、快速、全面地诊断病原体的宏基因组[1,7,8]。mNGS对病原菌鉴定具有较高的敏感性，且受抗生素使用的影响较小，是一种有前景的感染性病原体检测技术。

2.1 mNGS在细菌性感染中的应用

细菌是感染性疾病最常见的病原体之一。培养法是细菌分离的标准方法，但细菌培养时间长，且很多细菌难以培养，阳性率较低，多重感染易被忽略，以及标本易被污染能致假阳性等，给临床工作带来困扰，更不能满足急危重症感染性疾病的诊治需求[9]。采用mNGS可以避开传统检测方法的局限，迅速鉴定样本中的已知病原体，有效发现未知的病原体，为临床诊疗提供帮助。Wang等[10]对18例脑脊液标本的分析结果表明，mNGS与常规方法比较，可将结核性脑膜炎的结核分枝杆菌检出率提高到95.65%，固而认为mNGS是一种检测结核性脑膜炎患者脑脊液分枝杆菌的替代方法，值得作为脑脊液标本的一线检测方法。Zhang等[11]在135名细菌性脑膜炎患者中，应用mNGS诊断肺炎链球菌脑膜炎的敏感性和特异性分别为73.1%和88.1%，阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)分别为59.4%和93.2%，并且采集标本前使用抗生素治疗对检测结果的影响小于培养法。此外，mNGS对重症感染性疾病及不明原因发热具有重要的诊断价值[12，13]。有研究报道了一例高热男性患者，传统培养和血清学检测细菌均为阴性，而mNGS显示患者尿液标本中存在粪肠球菌，Sanger测序和qPCR分析进一步证实，经采用靶向抗生素治疗后患者很快康复[14]。以上结果显示mNGS作为一种新的不依赖培养的方法，显示了快速、敏感和准确的病原体鉴定能力，并能为临床医生制定合适的治疗方案提供依据。

2.2 mNGS在病毒性感染中的应用

目前病毒性疾病是以免疫学诊断为主，针对病毒DNA或RNA的检测方法，PCR、基因芯片等分子诊断方法的应用也较为广泛,但是这些方法都需要预判可能的病毒类型，无法诊断出未知的病毒性病原体。利用mNGS则无需预判病原体类型，也不存在靶向测序法中的偏依性[15]，甚至有可能发现新的病原体。如2014年刚果民主共和国爆发埃博拉出血热，Li等[16]应用mNGS从70例疑似埃博拉出血热患者的全血样本中检测到扎伊尔埃博拉病毒(Zaire ebolavirus)和其它潜在的病原体，包括15例恶性疟原虫感染和9例独立感染，以及乙型肝炎病毒(HBV)、EB病毒(Epstein-Barr Virus，EBV)、人佩吉病毒(Human Pegivirus 1，HPgV-1)、奥伦戈病毒(Orungo Virus)等，表明mNGS在广泛的病原体检测和疫情监测中有特别的作用。另外，mNGS对病毒检出率也高于传统检测方法。Jerome等[17]使用mNGS在40例罹患急性发热性疾病的英国旅客中检测出11例病毒感染，而传统方法仅有5例，mNGS检测出包括登革热病毒(Dengue Virus)、戊型肝炎病毒(HEV)、埃博拉病毒(Ebola Virus)、甲型肝炎(HAV)病毒、基孔肯雅病毒(Chikungunya Virus)和腮腺炎病毒(Mumps Virus)等，研究结果显示mNGS提高了对病毒感染诊断的敏感性，可以发现传统诊断方法漏诊的病例。

mNGS对新型冠状病毒的检出也有重要贡献。2019年12月武汉爆发了不明原因肺炎，Chen等[18]对2名与华南海鲜市场有独立接触史后并出现急性呼吸综合征患者提取其支气管肺泡灌洗液(BALF)RNA，用mNGS快速鉴定出一种新型冠状病毒(2019-nCoV)，并且根据基因分析，认为2019-nCoV很可能是一种独立从动物传染人类的新型冠状病毒。说明mNGS分析可获得无偏倚性的潜在病原体，在诊断不明原因肺炎中有重要作用[19]。与目前的微生物诊断技术相比，mNGS对病毒病原体诊断具有更全面的检测能力，尤其可以检测出未知病原体，发现新发传染病，帮助公共卫生机构更快更好地了解和应对病毒爆发流行[20]。

2.3 mNGS在真菌性感染中的应用

随着抗肿瘤药物等免疫抑制剂以及广谱抗菌药使用的增加，临床上合并真菌感染的病例在逐渐增多，特别是免疫力低下或者长期处于免疫抑制状态人群，比如HIV感染或者肿瘤患者。Zinter等[21]收集了41份免疫缺陷儿童的下呼吸道标本，通过mNGS分析，发现每个标本中都有大量的细菌、真菌、RNA病毒和DNA病毒，而传统方法诊断为阴性的样本中，有一半检测到了潜在病原体，其中34.1%的样品中检测到曲霉菌RNA，提示免疫缺陷儿童的肺部经常暴露于低水平曲霉菌中。Alonso等[22]在肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)患者的冷冻神经组织中提取DNA进行mNGS分析，鉴定出多种真菌属，包括念珠菌、马拉色菌、镰刀菌、葡萄孢菌、木霉菌和隐球菌，证实肌萎缩性脊髓侧索硬化症患者存在混合真菌感染。Zhang等[23]报道2例肋骨软组织肿块患者，最初被认为是软组织肿瘤，真菌培养为阴性，后来进行mNGS发现有隐球菌感染，经口服氟康唑治疗后，症状好转。临床上传统的真菌检测主要依靠常规镜检或者传统培养法，检测过程繁琐，培养周期过长，常常会延误诊断或者漏诊，导致感染加重，mNGS具有快速和敏感的特点，特别对常规方法难以检测出合并真菌感染的病例更有优势。

2.4 mNGS在寄生虫及其它感染中的应用

目前，寄生虫感染的确诊主要依靠患者的体液、分泌物、排泄物的镜检或临床免疫学检查，但是这些方法都对样本类型、收集时间等有严格要求，检验者的经验也对检验结果有较大影响。mNGS检测可以弥补目前检测方法的不足。Wilson等[24]对7例难诊断性亚急性或慢性脑膜炎患者的脑脊液进行mNGS分析的结果显示，1例感染猪带绦虫，1例感染HIV-1，另外4例分别感染新生隐球菌、米曲菌、荚膜组织胞浆菌、杜氏假丝酵母菌，这是第一次使用mNGS检测诊断出蛛网膜下腔神经囊虫病导致慢性脑膜炎的病例，固而认为mNGS是一种快速并且成本相对较低的方法，可以作为单一的诊断方法，无偏移地筛查脑脊液病原体。Hu等[25]用mNGS分析一例HIV感染患者的致死性脑损伤病原体，最后分析出感染病原体为弓形虫，并指出mNGS可能为弓型原虫脑炎诊断的有效方法。

支原体，钩端螺旋体用常规检测方法难以培养和鉴定，常常为阴性结果，但是mNGS可使不典型钩端螺旋体病早期得以确诊[26]。Wang等[27]对32例诊断为重症肺炎儿童的BALF分别进行传统方法和mNGS检测，其中15例样本用传统方法没有检测出病原体，但是32例标本使用mNGS均检测出包括肺炎支原体、腺病毒、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、巨细胞病毒和博卡病毒等病原体，表明使用mNGS可显著提高重症肺炎患儿病原菌检测的敏感性。Thoendel等[28]同样在培养阴性的假体关节感染标本中，通过mNGS检测出唾液支原体。这些结果说明当无临床表现，传统检验方法无法确定病原体时，mNGS检测可作为一种有效的补充方法。

3 mNGS在病原体检测中的问题及局限性

mNGS应用于临床检测还面临许多实际问题。(1)缺乏标准化的数据处理和数据分析；尚未建立统一的各类临床标本NGS的前处理标准[29]。(2)mNGS缺乏有效性验证，并且暂时还无法覆盖药敏结果，因此仍然需要结合传统的检测方法对疾病进行诊断[30]。(3)假阳性结果，mNGS可能由于污染而出现假阳性结果，包括环境中正常的人体菌落，采集样本过程中、实验室检测试剂等，都可能成为污染源。对此，实验室医生可通过增加对实验室试剂定期评估、设置阴性对照、严格遵守操作流程、尽可能保持无核酸环境等措施来减少假阳性结果出现[31]。(4)假阴性结果，大部分病原体RNA容易降解，运输及保存过程中没有严格执行运输标准可能是导致其降解的原因。(5)宏基因组学提供了大量的数据，需要专业的生物信息团队进行大数据分析，并不断改进技术和软件的应用，使结果的成本和时间下降[32]。(6)目前大部分研究是以病原体的定性分析为主，有待进一步扩大数据库规模，将定性信息转变为定量信息，增加临床诊断结果的准确性[33]。

4 小 结

mNGS技术可以突破传统检测方法的局限性，对细菌、真菌、病毒、寄生虫等病原体获得快速、广泛、灵敏度高的诊断结果，针对难以培养的病原体及不明原因无法预判的感染性疾病患者，可利用mNGS技术得到覆盖齐全、准确的病原体信息，为临床治疗特别是个体化用药提供依据。尽管mNGS相比较于传统检测方法有许多优势，但是目前并不能完全取代传统方法，两种方法相结合可以提高临床诊断率。今后要制定科学的mNGS检测流程、临床应用指南、加快数据库建设、罕见病原体基因谱研究，扩展其潜在的应用领域，进一步提高灵敏度和特异度，进一步推进临床微生物学和感染病学的发展，更好地服务于临床，更多地使患者获益。

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